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J-GLOBAL ID：200902205511152413   整理番号：09A0761349

多コピー数プラスミドの位置指定突然変異誘発:Red/ET組換及びユニークな制限部位除去

Site-directed mutagenesis of multi-copy-number plasmids: Red/ET recombination and unique restriction site elimination

著者 (5件)： NOLL Stephan (Gene Bridges GmbH, Heidelberg, DEU) ,  HAMPP Gabriele (Gene Bridges GmbH, Heidelberg, DEU) ,  BAUSBACHER Hanna (Gene Bridges GmbH, Heidelberg, DEU) ,  PELLEGATA Natalia S. (Helmholtz Zentrum Muenchen, Neuherberg, DEU) ,  KRANZ Harald (Gene Bridges GmbH, Heidelberg, DEU)
資料名： BioTechniques  (BioTechniques)
巻： 46  号： 7  ページ： 527-528,530,532-533  発行年： 2009年06月 
JST資料番号： C0930C  ISSN： 0736-6205  資料種別： 逐次刊行物 (A)
記事区分： 短報  発行国： アメリカ合衆国 (USA)  言語： 英語 (EN)

抄録/ポイント： ヌクレオチド配列のサイズ及び配列要求にかかわらず効率的で幅広くプラスミドを修飾できるRed/ET組換及びユニークな制限部位除去に基づく新規の位置指定プラスミド突然変異誘発法を示した。Redは大腸菌にてDNAのサイズ及び配列非依存性操作であるために優れた技術であり,線形dsDNAを示すエキソヌクレアーゼのRedα及びssDNA末端からスタートする鎖長アニーリングと交換反応を介在するRedβからなる2成分酵素である。基質プラスミドで欠如している線形化部位(LS)及び組換に対して隣接の特異的な50bp標的と連結しているプライマーにより薬物耐性(drug^R)カセットをPCRで増幅した。基質プラスミド及びdrug^R-LSカセットをRed/ET組換ができる大腸菌細胞内へエレクトロポレーションで導入した。組換プラスミドを単離するために組換第2段階でdrug^R-LSカセットの置換に修飾ssDNA及びdsDNAを使用して望ましい突然変異を誘導した。親プラスミドの選択的in vitro消化及び再形質転換の後,pUC19のlacZα遺伝子(2686bp)内で17bp欠失を除去する合成97ntのオリゴヌクレオチドを用いて~38%の突然変異効率を達成できた。また,遺伝子の標的ベクターpGTCC(13083bp)にてマウスCdkn1bのコドン9及び76を共に置換するのにPCRフラグメントを使用して類似の効率結果を得た。

シソーラス用語： *プラスミド ,  *部位特異的変異誘発 ,  *相同組換 ,  ヌクレオチド配列 ,  タンパク質 ,  酵素 ,  大腸菌 ,  一本鎖DNA ,  DNA【核酸】 ,  温度 ,  選択性 ,  プライマー【遺伝】 ,  *遺伝子 ,  薬物耐性 ,  PCR法 ,  マウス ,  コドン
準シソーラス用語： Cdkn1b遺伝子 ,  pUC19プラスミド ,  Red/ET組換 ,  Redα蛋白質 ,  Redβ蛋白質 ,  アニーリング温度 ,  位置指定突然変異誘発 ,  多コピー数プラスミド ,  薬物耐性遺伝子 ,  二成分酵素 ,  lacZα遺伝子

分類 (2件)： 遺伝子の構造と化学  (EC02020U) ,  微生物の生化学  (EG03020N)

タイトルに関連する用語 (5件)： コピー数 ,  プラスミド ,  位置指定突然変異誘発 ,  組換 ,  制限