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J-GLOBAL ID：201602255386965897   整理番号：16A1121927

RNA可視化IN SITUハイブリダイゼーション技術を用いて、感染細胞におけるコレラウイルスRNAの定位と分布を検討した。【JST・京大機械翻訳】

Study of Location and Distribution of Classical Swine Fever Virus RNA in PK15 Cells by Visualization in Situ Hybridization Technology

著者 (11件)： Zhang Yujie (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Zhao Yan (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Xu Lu (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Zhang Qianyi (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Chen Kai (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Sun Yongfang (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Zou Xingqi (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Zhu Yuanyuan (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Zhao Qizu (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Ning Yibao (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab) ,  Wang Qin (China Institute of Veterinary Drug Control/National Classical Swine Fever Reference Lab)
資料名： Zhongguo Nongye Kexue  (Zhongguo Nongye Kexue)
巻： 49  号： 12  ページ： 2397-2407  発行年： 2016年 
JST資料番号： W1459A  ISSN： 0578-1752  CODEN： CKNYAR  資料種別： 逐次刊行物 (A)
記事区分： 原著論文  発行国： 中国 (CHN)  言語： 中国語 (ZH)

抄録/ポイント： 【目的】IN VITROで感染した細胞におけるCSFV RNAの分布と局在を研究するために,IN SITUハイブリダイゼーション法を確立した。[方法]本研究では、GENBANKで公表されたCSFV、BVDVとBDVの全配列を比較することにより、BVDVとBDVの相同性を避け、CSFV RNA及び参照遺伝子Β-アクチンの特異的プローブを設計した。CSFV中の致病力毒株(HEBHH95分の1)を参考菌とし、PK15細胞にウイルスを培養し、RNA可視化IN SITUハイブリダイゼーションの特異的プローブと相応の試薬を加え、蛍光共焦点顕微鏡を用いてイメージング観察を行った。観察結果、蛍光強度、再現性などの要素を総合的に分析し、直交試験を用いて、IN SITUハイブリダイゼーション過程に重要な影響を及ぼすプロテイナーゼK濃度とホルムアルデヒド固定時間を最適化し、CSFV RNA可視化IN SITUハイブリダイゼーション技術を確立し、FAT法と比較し、この技術の感度を比較した。現在、中国で流行しているCSFV 1.1、2.1、2.2、2.3遺伝子亜型及びBVDV、PPV、PRV及びPCV-2ウイルスを用いて、特異性試験を行った。最終的に,PK15細胞をCSFVにより感染させ,ウイルス感染後0.5,1,3,6,8,10,14,18,24,36,48,72,96時間(HOURS POST INOCULATION,変異)を採取した。各時間ごとに2つの反復を行い、CSFV RNA可視化IN SITUハイブリダイゼーション技術を用いて検査を行った。細胞におけるウイルス蛋白質の局在と分布を確認するために,PK15細胞におけるE2蛋白質の発現を,FAT法によって研究した。[結果]この技術を用いて、蛍光共焦点顕微鏡下で、CSFV RNAの細胞中での定位を観察することができた。プロテイナーゼKの濃度は1:1であった。1000,ホルムアルデヒドの固定時間が30分であるとき,最適反応条件は以下の通りであった。感度試験により、この技術のウイルスに対する検出限界は10~(-8)/200ΜLであり、FATより3.5倍高いことが分かった。特異性試験の結果、このプローブはCSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亜型と結合でき、BVDV、PPV、PCV-2、PRVと交差反応がないことが分かった。この技術を用いて、CSFV RNA感染後の標的細胞における定位と分布の研究結果を示した。0.5変異は核と細胞質でいずれもRNAを検出することができ、0.5-6変異 RNAは主に核内に分布し、核内に濃縮される。10変異の細胞質内のRNAは次第に増加し、核内のRNAは次第に減少し、24変異 RNAは主に細胞質内の細胞核の周囲に集中している。36変異の核外RNAの大量集積は増加し、72変異はピーク値に達した。96変異 RNAの総量は減少した。FATの結果は以下のことを示した。8変異は少数の細胞の細胞質内でウイルスE2蛋白を検出し、10-24変異の発現量はずっと少ない。36変異の蛋白質発現は増加し,72時間後に最大値に達した。96変異蛍光信号は強く弱くなった。細胞質におけるウイルス蛋白質の凝集数は,細胞質中のRNA含有量と正の相関があった。[結論]CSFV RNA可視化IN SITUハイブリダイゼーション検出技術を初めて確立し、CSFVCSFV株の細胞中のRNAの定位分布について研究を行い、ウイルスRNAの吸着と進入Ba細胞の時間が0.50.5より早いことを発見した。CSFV RNAは核内での生活史を有することが観察された。Data from the ScienceChina, LCAS.【JST・京大機械翻訳】

シソーラス用語： アクチン ,  ウイルスタンパク質 ,  蛍光 ,  検出限界 ,  再現性 ,  最適化 ,  共焦点顕微鏡 ,  相同性 ,  *RNA【核酸】 ,  感受性試験 ,  脂肪族アルデヒド
準シソーラス用語： 蛋白質発現 ,  特異性 ,  蛍光強度 ,  *ウイルスRNA , 【Automatic Indexing@JST】

著者キーワード (5件)： Classical Swine Fever Virus (CSFV) ,  location ,  distribution ,  RNA in situ hybridization (ISH) ,  Fluorescent antibody test (FAT)

分類 (3件)： ウイルス感染の生理と病原性  (EG04042Y) ,  神経系の疾患  (GN03000O) ,  分子遺伝学一般  (EC02010J)

物質索引 (1件)： ホルムアルデヒド

タイトルに関連する用語 (9件)： RNA ,  可視化 ,  ハイブリダイゼーション ,  感染 ,  細胞 ,  コレラ ,  ウイルスRNA ,  定位 ,  分布