遺伝子治療のためのエンドトキシンを含まないかエンドトキシンを減少させた核酸及び/またはオリゴヌクレオチドの製造方法

発明者： , ,
出願人/特許権者：
代理人 (1件)：塩澤寿夫 (外1名)
公報種別：公表公報
出願番号（国際出願番号）：特願平7-520389
公開番号（公開出願番号）：特表平9-508406
出願日： 1995年02月03日
公開日（公表日）： 1997年08月26日
要約：

【要約】遺伝子治療において使用するための核酸及び/またはオリゴヌクレオチドの単離及び精製方法であって、該核酸及び/またはオリゴヌクレオチドが本質的に生物学的な原料から単離及び精製され、前記の本質的に生物学的なソースを溶解し、得られるフラクションは任意に、遠心分離、濾過等のそれ自体公知の機械的方法により前記生物学的なソースの残部を含まないようにされるか減少させられており、このように処理されたフラクションを次にエンドトキシンの除去のためにアフィニティクロマトグラフィー材料または無機クロマトグラフィー材料で処理し、その後、アニオン交換体材料からRNA が脱着し始めるイオン強度に対応する濃度よりも少なくとも100 mM高い濃度の塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度においてのみアニオン交換体からDNA が脱着し始めるように設計されたアニオン交換体上で前記核酸及び/またはオリゴヌクレオチドを単離することを特徴とする前記方法。

請求項（抜粋）：

1 遺伝子治療において使用するための核酸及び/またはオリゴヌクレオチドの単離及び精製方法であって、前記核酸及び/またはオリゴヌクレオチドが本質的に生物学的な原料から単離及び精製され、前記の本質的に生物学的な原料を溶解し、得られるフラクションは任意に、遠心分離、濾過等のそれ自体知られた機械的方法により前記生物学的な原料の残部を含まないか、または減少させ、このように処理されたフラクションを次にエンドトキシンの除去のためにアフィニティクロマトグラフィー材料または無機クロマトグラフィー材料で処理し、その後、アニオン交換体材料からRNA が脱着し始めるイオン強度に対応する濃度よりも少なくとも100 mM高い濃度の塩化ナトリウム溶液に対応するイオン強度においてのみアニオン交換体からDNA が脱着し始めるように設計されたアニオン交換体上で前記核酸及び/またはオリゴヌクレオチドを単離することを特徴とする前記方法。2 アニオン交換基で修飾された多孔性または非多孔性無機及び/または有機支持体材料を無機クロマトグラフィー材料の支持体材料として使用することを特徴とする請求項1に記載の方法。3 シリカゲル、珪藻土、ガラス、酸化アルミニウム、酸化チタン、酸化ジルコニウム、ヒドロキシアパタイトを無機支持体材料として使用し、デキストラン、アガロース、アクリルアミド、ポリスチレン樹脂、あるいは上記の材料のコポリマーを有機支持体材料として使用する請求項1および/または2のいずれかに記載の方法。4 前記修飾支持体材料が、請求項3に挙げた支持体材料の1種を、第1の段階で一般式IR1R2R3SiR4 (I)(式中、R1は1〜10の炭素原子のアルコキシ基、特に-OCH3、-OC2H5あるいは-OC3H7、またはハロゲン原子、特に-Cl、または1〜6の炭素原子の同じであるか異なるアルキル基を有するジアルキルアミノ基であり; R2及びR3は、独立に1〜10の炭素原子の炭化水素基、特に-CH3、-C2H5あるいは-C3H7、または1〜10の炭素原子のアルコキシ基、特に-OCH3、-OC2H5あるいは-OC3H7、またはハロゲン原子、または少くとも1つのオキサもしくはアミノ基によって中断される4〜20の炭素原子のアルキル残基であって、前記残基は1以上のハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシまたはアリールで置換されていてもよく; R4は1〜20の炭素原子の炭化水素鎖、または少くとも1つのオキサもしくはアミノ基によって中断されるアルキル残基であって、前記残基は1以上のハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アリール及び/またはエポキシにより置換されていてもよく、特にである)のシラン化剤と反応させ、第2の段階で、第1の段階で修飾された支持体を一般式IIX-R-Y (II)(式中、Xはアミノ、ヒドロキシ、エポキシ基またはハロゲン原子であり; Rは、2〜20の炭素原子の炭化水素鎖、または少くとも1のオキサもしくはアミノ基によって中断されるアルキル残基であって、前記残基は1以上のハロゲン、シアノ、ニトロ、アミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルコキシ、ヒドロキシ、アリール及び/またはエポキシにより置換されていてもよく; Yはアニオン交換材料を形成する官能基を有し、1〜10の炭素原子を有する炭化水素基であって、1以上のアミノ、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、四級アルキルアミノにより置換されていてもよい)の試薬と反応させることにより得る請求項1〜3の少なくとも1つに記載の方法。5 ジエチルアミノエチル(DEAE)基またはジメチルアミノエチル(DMAE)基が直接またはいわゆるスペーサーを介して支持体の表面に配置されている請求項1〜4の少なくとも1つに記載の方法。6 プラスミド、コスミド、ウィルスから単離されたDNA 等のDNA、並びにその酵素的あるいは化学的に修飾された形態、及び/または任意の形態及び任意の起源のRNA、またはリボザイムを前記核酸として単離する請求項1〜5の少なくとも1つに記載の方法。7 核酸を含むフラクションの、Triton X 100のような非イオン性洗剤による処理、またはニッケル/NTA、ニッケル/IDA、ポリミキシン、DNA ETOXのようなアフィニティクロマトグラフィー支持体による処理を、核酸フラクションからエンドトキシンを除去するために行う請求項1〜6の少なくとも1つに記載の方法。8 本質的にガラスからなるもののような無機支持体材料で、核酸を含み、高い塩濃度を有するフラクションを処理することにより高イオン強度条件下に核酸を溶出するのに必要な塩を除去するものであって、核酸が無機支持体の表面に吸着し、水または低イオン強度のバッファー溶液で後に核酸を脱着する請求項1〜7の少なくとも1つに記載の方法。9 特に、濾過する試料の流動方向に向かって孔径が減少しているフィルター及び/またはガラス、シリカゲル、アルミナもしくはパックされた珪藻土、あるいは繊維ガラス及びシリカゲル、並びにセルロースでできたからみ合わされているか接着されている不織物、紙、プレス紙、紙からできている不織物からなるフィルター層を有するフィルターを使用して、細胞溶解物の細胞断片を濾過により分離する請求項1〜7の少なくとも1つに記載の方法。10 核酸を含む細胞溶解物の試料の予備的な精製を非修飾珪藻土の層で行う請求項1〜9の少なくとも1つに記載の方法。11 遺伝子治療用の核酸を含む薬剤の調製のための核酸の分離、精製及び単離のための請求項1〜6の少なくとも1つに記載のアニオン交換体の使用。12 生体内(in vivo)及び生体外(ex vivo)遺伝子治療のための請求項11に記載の使用。13 嚢胞性繊維症あるいは筋ジストロフィーのような遺伝学的に引き起こされる疾患の治療のための薬剤の調製のための請求項11または12に記載の使用。14 アンチセンス/センス戦略による生体内(in vivo)及び生体外(ex vivo)遺伝子治療のためのオリゴヌクレオチドの精製のための請求項1〜6の少なくとも1つに記載のアニオン交換体の使用。15 生体内(in vivo)及び生体外(ex vivo)遺伝子治療用の、そのままのウィルス粒子を含むウィルス粒子の精製のための請求項1〜6の少なくとも1つに記載のアニオン交換体の使用。16 請求項1〜10のいずれかに記載の方法における核酸の精製のための試薬としてのイソプロパノールの使用。17 特に、ユーザーによって最終的に混合される濃縮形態であってもよい試薬、核酸の分離のためのクロマトグラフィー材料、水溶液(バッファー、任意にユーザーによって最終的に調整されるための濃縮形態にあってもよい)、その他の助剤、及びエンドトキシンの除去のための物質を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法を実施するために必要な成分を含むキット。

IPC (7件)：

C07H 21/00 , A61K 31/70 ABJ , A61K 48/00 ADU , B01J 20/26 , C07H 1/08 , C07H 21/02 , C07H 21/04

FI (8件)：

C07H 21/00 , A61K 31/70 ABJ , A61K 48/00 ADU , B01J 20/26 H , C07H 1/08 , C07H 21/02 , C07H 21/04 B , C07H 21/04 Z

引用特許：

審査官引用 (3件)

特開昭63-154696
特開昭58-013519
特開平2-295484

前のページに戻る