特許

J-GLOBAL ID：200903006669113173

疾患特異的遺伝子の定量および発見のための高容量in-situ mRNA ハイブリダイゼーション法

発明者： ジョーンズ,デイビッド・エイ ,  ハリス,ダグラス・ダブリュー ,  ケンリック,マイケル・ケイ ,  トーマス,ニコラス
出願人/特許権者： ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー ,  ニーコメド・アメルシャム・パブリック・リミテッド・カンパニー
代理人 (1件)： 青山 葆 (外1名)
公報種別：公表公報
出願番号（国際出願番号）：特願平9-538065
公開番号（公開出願番号）：特表2001-509662
出願日： 1997年04月03日
公開日（公表日）： 2001年07月24日
要約：

【要約】高容量基材ベースのin-situハイブリダイゼーションアッセイが、シンチラントを含有するマイクロタイター・プレートを利用して開発された。本技術は、10-20コピー/細胞のレベルで、特異的なmRNA転写体を信頼性を持って検出する感度を有している。対照プローブに由来する非相同性ベクターと同様に、c-fosおよびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対する高特異活性を有するアンチセンス・リボプローブが、牛胎児血清(FCS)または血小板由来増殖因子(PDGF)で刺激後の静止状態ラットA-10平滑筋細胞におけるmRNAレベル比較のため使用された。最大c-fos誘導が、PDGF30ng/mlまたは10%FCSでの刺激に続き引き起こされ、これは700cpmのc-fosプローブからのシグナルと一致することが示された。50cpmの非相同性対照のバックグラウンドおよび1,700cpmのGAPDHシグナルは、PDGFまたは血清の刺激に非依存的であった。30ng/mlのPDGFを使用し、静止状態細胞を種々の時点で刺激して、30分でピークに達し、3時間までに50%未満まで減少するc-fos mRNAについての誘導時間-経過が供された;バックグラウンドレベル発現への復帰は、6時間後に出現し、並列的なノーザンブロッティング実験との比較は、このin-situアッセイが少なくとも20倍以上の感度であり、実施するのがより迅速であることを証明した。

請求項（抜粋）：

-1- A.少なくとも1つの基材上で,2以上の物理的に区別される細胞の試料を培養し; B.該細胞の細胞形態内に核酸を保存し保持する固定液と該細胞とを接触させ; C.それにより、標識化核酸プローブが形態学的に無傷な細胞を透過し,標的核酸配列とハイブリダイズする条件下で,該標識化核酸プローブに該固定された細胞を曝露し;次いで D.該標的核酸配列にハイブリダイズする該プローブの量を測定する;工程を含むことを特徴とする、形態学的に無傷の細胞において標的核酸配列の量を定量する方法。 -2- さらに、工程Cに先立ち:該細胞に膜孔形成試薬を添加する工程を含む請求項1記載の方法。 -3- 該孔形成試薬が、ポリオキシエチレン 23 ラウリルエーテル(Brij35);ポリオキシエチレン 20 セチルエーテル(Brij58);ドデシル硫酸ナトリウム;3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS TM)およびポリオキシエチレンエーテル CAS#9002-93-1(Triton X-100)からなる群から選択される洗浄剤である請求項2記載の方法。 -4- 工程Aがさらに:少なくとも1種の化学的存在物で該細胞を処理することを含む請求項1記載の方法。 -5- 該プローブが特徴付けされていない遺伝子配列に由来する請求項1記載の方法。 -6- 該基材が、マルチウェルプレートである請求項1記載の方法。 -7- 該プレートが、シンチラントを含有する請求項6記載の方法。 -8- 該基材が、微粒子である請求項1記載の方法。 -9- 該微粒子が、シンチラントを含有する請求項8記載の方法。 -10- 該標的核酸配列にハイブリダイズした該プローブ量が分光学的技術により測定される請求項1記載の方法。 -11- 分光学的技術がシンチレーション、蛍光、紫外線、可視およびルミネセンスよりなる群から選択される請求項10記載の方法。 -12- A.マルチプレート上で1以上の物理的に区別される細胞の試料を培養し; B.該細胞の細胞形態内に核酸を保存し保持する固定液と該細胞とを接触させ; C.それにより該標識化プローブが形態学的に無傷な細胞を透過し,標的核酸配列にハイブリダイズする条件下で,該標識化核酸プローブに該固定された細胞を曝露し;次いで D.該標的核酸配列にハイブリダイズした該プローブの量を測定する; 工程を含むことを特徴とする、形態学的に無傷な細胞において標的核酸配列の量を定量する方法。 -13- さらに、工程Cに先立って:膜孔形成試薬を該細胞に添加する工程を含む請求項12記載の方法。 -14- 該孔形成試薬が、ポリオキシエチレン 23 ラウリルエーテル(Brij35);ポリオキシエチレン 20 セチルエーテル(Brij58);ドデシル硫酸ナトリウム;3-[(3-コラミドプロピル)-ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート(CHAPS TM)およびポリオキシエチレンエーテル CAS#9002-93-1(Triton X-100)よりなる群から選択された洗浄剤である請求項3記載の方法。 -15- 工程Aがさらに:少なくとも1種の化学的存在物で該細胞を処理することを含む請求項12記載の方法。 -16- 該プローブが特徴付けされていない遺伝子配列に由来する請求項12記載の方法。 -17- 該プレートがシンチラントを含有する請求項12記載の方法。

IPC (4件)：

C12N 15/09 ,  C12Q 1/68 ,  G01N 33/53 ,  G01N 33/566

FI (4件)：

C12Q 1/68 A ,  G01N 33/53 M ,  G01N 33/566 ,  C12N 15/00 A