遺伝子発現の連続分析用マイクロアッセイ及びその応用

発明者： , ,
出願人/特許権者： ,
代理人 (1件)：野河信太郎
公報種別：公表公報
出願番号（国際出願番号）：特願2000-596176
公開番号（公開出願番号）：特表2002-535012
出願日： 2000年01月25日
公開日（公表日）： 2002年10月22日
要約：

【要約】以下の連続工程:(1) 常磁性ビーズに共有結合したオリゴ(dT)25を用いて、少量の生物学的試料から単一工程でmRNAを抽出し、(2) 該mRNA から二本鎖cDNAライブラリーを生成し、(3) Sau3A I を用いて得られたcDNAを切断し、(4) 切断したcDNAを2つのアリコートに分け、(5) 2つの各アリコートに含まれるcDNAを、Sau3A I 制限部位を介して以下の式:GATCGTCCC-X1 又は GATCGTCCC-X2[ここで、30〜37ヌクレオチドからなり、異なるX1及びX2は、55〜65°CのTmを有する20〜25 bpのPCRプライミング部位を含む]の1つを有する二本鎖のcDNA一分子からなるリンカーに連結し、(6) 工程(5)で得た生成物をタグ酵素BsmF Iで消化し、(7) DNAポリメラーゼを用いてBsmF Iタグを平滑末端にし、異なるリンカーと連結したタグを混合し、(8) 工程(7)で得たタグを連結して、DNAリガーゼでジタグを形成し、(9) 工程(8)で得たジタグを、55〜65°CのTmを有する20〜25bpからなるプライマーを用いて増幅し、(10) 工程(9)で得た増幅生成物をSau3A I で消化して増幅生成物から20〜28bpのジタグを単離し、消化生成物を分離し、(11)工程(10)で得たジタグを連結してコンカテマーを形成し、このコンカテマーを精製して300bpより大きいコンカテマーを分離し、(12) このコンカテマーをクローニングしてシーケンシングし、かつ(13) 種々の得られたタグを分析するからなる、生物学的試料の特異的な状態を明らかにすることのできるタグライブラリーを得る方法。

請求項（抜粋）：

以下の連続工程:(1) 常磁性ビーズに共有結合したオリゴ(dT)25を用いて、少量の生物学的試料から単一工程でmRNAを抽出し、(2) 以下の工程:* Rnase H 活性のない逆転写酵素を用いて、第一の相補的な一本鎖cDNAへの該mRNAの鋳型の逆転写によってcDNAの第一鎖を合成し、* 大腸菌のDNAポリメラーゼによって形成されるmRNA-cDNAハイブリッドで、mRNAのニックトランスレーションによりcDNAの第二鎖を合成するによって該mRNA から二本鎖cDNAライブラリーを生成し、(3) アンカー酵素として制限エンドヌクレアーゼSau3A I を用いて得られたcDNAを切断し、(4) 切断したcDNAを2つのアリコートに分け、(5) 2つの各アリコートに含まれるcDNAを、Sau3A I 制限部位を介して以下の式: GATCGTCCC-X1 又は GATCGTCCC-X2[ここで、30〜37ヌクレオチドからなり、異なるX1及びX2は、55〜65°CのTmを有する20〜25 bpのPCRプライミング部位を含み、かつGATCGTCCC (SEQ ID NO:1)はBsmF I制限部位に結合したSau3A I 制限部位に相当する]の1つを持つ二本鎖のcDNA一分子からなるリンカーに連結し、 (6) 工程(5)で得た生成物をタグ酵素BsmF Iで消化し、転写物-特異的なタグに相当するcDNAの固定した短い断片を有するリンカーを放出し、この消化で最初のmRNAに特異的なBsmF I タグを得て、(7) DNAポリメラーゼ、好ましくはT7 DNAポリメラーゼ又はVentポリメラーゼを用いてBsmF I タグを平滑末端にし、異なるリンカーと連結したタグを混合し、(8) 工程(7)で得たタグを連結して、DNAリガーゼでジタグを形成し、(9) 工程(8)で得たジタグを、55〜65°CのTmを有する20〜25bpからなるプライマーを用いて増幅し、(10) 工程(9)で得た増幅生成物をアンカー酵素Sau3A I で消化して増幅生成物から20〜28bpのジタグを単離し、適当なゲル電気泳動で消化生成物を分離し、(11) 工程(10)で得たジタグを連結してコンカテマーを形成し、このコンカテマーを精製して300bpより大きいコンカテマーを分離し、(12) このコンカテマーをクローニングしてシーケンシングし、かつ(13) 種々の得られたタグを分析するからなることを特徴とする、生物学的試料の特異的な状態を明らかにすることのできるタグライブラリーを得る方法。

IPC (2件)：

C12N 15/09 ZNA , C12Q 1/68

FI (2件)：

C12Q 1/68 A , C12N 15/00 ZNA A

Fターム (15件)：

4B024AA11 , 4B024AA20 , 4B024CA01 , 4B024CA04 , 4B024CA10 , 4B024HA19 , 4B063QA20 , 4B063QQ41 , 4B063QR06 , 4B063QR07 , 4B063QR14 , 4B063QR31 , 4B063QS12 , 4B063QS15 , 4B063QS28

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