特許

J-GLOBAL ID：200903073968235179

DNAプローブにおいてシトシンのメチル化を検出するリガーゼ/ポリメラーゼ法

発明者： オレク,アレクサンダ ,  ベルリン,クルト
出願人/特許権者： エピゲノミクス アーゲー
代理人 (1件)： 荒井 鐘司 (外2名)
公報種別：公表公報
出願番号（国際出願番号）：特願2001-561769
公開番号（公開出願番号）：特表2003-523752
出願日： 2001年02月23日
公開日（公表日）： 2003年08月12日
要約：

【要約】本発明は、ゲノムDNAプローブの中のシトシンのメチル化とSNPsを同時に検出するのに特に適した方法を提供する。【解決手段】 ゲノムDNAプローブの中の5-メチルシトシンの検出方法であって、下記ステップ、(a)DNAプローブからのゲノムDNAを化学試薬と反応させ、ここで5-メチルシトシンとシトシンを異なる形で反応させ、そのためにこれらが反応後DNA二重らせんにおいて異なる塩基対挙動を示し;(b)プライマーとして少なくとも一つのオリゴヌクレオチド(タイプA)およびポリメラーゼを用いて予備処理したDNAを増幅し;(c)一組のオリゴヌクレオチドを増幅した前記ゲノムDNAとハイブリッド化して二重らせんを形成し、ここでこの組のオリゴヌクレオチドはタイプBとタイプCのいろいろな種から構成され、そしてタイプBの前述のハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドはその3’-末端基と直接または塩基10個までの間隔を置いてその位置に隣接し、その位置はゲノムDNAプローブにおけるそのメチル化に関して調べる必要があり、ここで標的分子の第2の領域において第2のオリゴヌクレオチド(タイプC)はハイブリッド化されるので、第2のオリゴヌクレオチド(タイプC)は個々のヌクレオチドまたは10個までのヌクレオチドに存在するある大きさの単位の空所を介して第1のハイブリッド化されたオリゴヌクレオチド(タイプB)の3’-末端基により前述の選択された位置の部位において分離され;(d)n個のヌクレオチドの周知の配列を用いて、せいぜいヌクレオチドの数のポリメラーゼを介してオリゴヌクレオチド(タイプB)の長さを拡大し、ポリメラーゼはタイプBのオリゴヌクレオチドの3’-末端基とタイプCのオリゴヌクレオチドの5’-末端基の間にあり、ここで長さの拡大はゲノムDNAプローブにおけるそれぞれのシトシンのメチル化の状況に依存し;(e)リガーゼの存在下で前記オリゴヌクレオチドを一定温度で培養し、ここでポリメラーゼ反応による長さが拡大したタイプBの第1のオリゴヌクレオチドとタイプCの第2のオリゴヌクレオチドは隣接して結合し、それにより連結生成物が得られる。ただし、これは、タイプBのオリゴヌクレオチドの長さが拡大する先行のステップにおいて、長さが拡大されたオリゴヌクレオチドの存在する3’-ヒドロキシ官能基を有する3’-末端基が、タイプCの前記オリゴヌクレオチドの5’-末端基に、直接、隣接しているように生じる場合に起こり;(f)連結生成物が生成しているか否か検出する;を行うことを特徴とする前記方法。

請求項（抜粋）：

ゲノムDNAプローブにおいて5-メチルシトシンを検出する方法であって、下記ステップ、 (a)DNAプローブからのゲノムDNAを化学試薬と反応させ、ここで5-メチルシトシンとシトシンを異なる形で反応させ、そのためにこれらが反応後DNA二重らせんにおいて異なる塩基対挙動を示し; (b)プライマーとして少なくとも一つのオリゴヌクレオチド(タイプA)およびポリメラーゼを用いて予備処理したDNAを増幅し; (c)一組のオリゴヌクレオチドを増幅した前記ゲノムDNAとハイブリッド化して二重らせんを形成し、ここでこの組のオリゴヌクレオチドはタイプBとタイプCのいろいろな種から構成され、そしてタイプBの前述のハイブリッド化されたオリゴヌクレオチドはその3’-末端基と直接または塩基10個までの間隔を置いてその位置に隣接し、その位置はゲノムDNAプローブにおけるそのメチル化に関して調べる必要があり、ここで標的分子の第2の領域において第2のオリゴヌクレオチド(タイプC)はハイブリッド化されるので、第2のオリゴヌクレオチド(タイプC)は個々のヌクレオチドまたは10個までのヌクレオチドに存在するある大きさの単位の空所を介して第1のハイブリッド化されたオリゴヌクレオチド(タイプB)の3’-末端基により前述の選択された位置の部位において分離され; (d)n個のヌクレオチドの周知の配列を用いて、せいぜいヌクレオチドの数のポリメラーゼを介してオリゴヌクレオチド(タイプB)の長さを拡大し、ポリメラーゼはタイプBのオリゴヌクレオチドの3’-末端基とタイプCのオリゴヌクレオチドの5’-末端基の間にあり、ここで長さの拡大はゲノムDNAプローブにおけるそれぞれのシトシンのメチル化の状況に依存し; (e)リガーゼの存在下で前記オリゴヌクレオチドを一定温度で培養し、ここでポリメラーゼ反応による長さが拡大したタイプBの第1のオリゴヌクレオチドとタイプCの第2のオリゴヌクレオチドは隣接して結合し、それにより連結生成物が得られる。ただし、これは、タイプBのオリゴヌクレオチドの長さが拡大する先行のステップにおいて、長さが拡大されたオリゴヌクレオチドの存在する3’-ヒドロキシ官能基を有する3’-末端基が、タイプCの前記オリゴヌクレオチドの5’-末端基に、直接、隣接しているように生じる場合に起こり; (f)連結生成物が生成しているか否か検出する;を行うことを特徴とする前記方法。

IPC (5件)：

C12N 15/09 ZNA ,  C12Q 1/68 ,  G01N 27/62 ,  G01N 33/53 ,  G01N 37/00 102

FI (5件)：

C12Q 1/68 A ,  G01N 27/62 V ,  G01N 33/53 M ,  G01N 37/00 102 ,  C12N 15/00 ZNA A

Fターム (25件)：

4B024AA11 ,  4B024AA20 ,  4B024CA01 ,  4B024CA09 ,  4B024CA20 ,  4B024HA08 ,  4B024HA13 ,  4B024HA14 ,  4B024HA20 ,  4B063QA01 ,  4B063QQ02 ,  4B063QQ03 ,  4B063QQ08 ,  4B063QQ62 ,  4B063QR08 ,  4B063QR14 ,  4B063QR32 ,  4B063QR50 ,  4B063QR56 ,  4B063QR62 ,  4B063QR82 ,  4B063QS25 ,  4B063QS34 ,  4B063QX02 ,  4B063QX04