特許
J-GLOBAL ID：200903097345661378
改善されたNAD-依存性を有すデヒドロゲナーゼ、その製造方法およびその用途
発明者：
,
出願人/特許権者：
代理人 (1件)：
江崎 光史 (外3名)
公報種別：公表公報
出願番号（国際出願番号）：特願平11-546407
公開番号（公開出願番号）：特表2001-526547
出願日： 1999年03月18日
公開日（公表日）： 2001年12月18日
要約：
【要約】有利なNADH-依存正デヒドロゲナーゼのNADH-特異性は関連アミノ酸配列の遺伝子工学的に変更して補酵素の結合領域で塩基性を低下させることによって改善することができる。NAD+≧20のkcat/KM値に相当する調剤目的に役立つNADH-依存性を有するデヒドロゲナーゼは微生物的に得ることができる。この目的のためには、遺伝子コードに遺伝子配列を持つ酵素についてコード化する微生物を使用する。この遺伝子配列は塩基性アミノ酸が少なくとも部分的に補酵素結合部で無帯電のアミノ酸で交換されているアミノ酸配列を持つ酵素についてコード化している。択一的にまたは追加的に塩基性または正に帯電したまたは無帯電のアミノ酸は負に帯電したアミノ酸に交換されてもよい。本発明の方法はN-末端に酵素結合場所を持つ短鎖のデヒドロゲナーゼを得るのに特に有利に使用される。実施例によればアルコールデヒドロゲナーゼは、オーバーエクスプレス法で突然変異した遺伝子を含有するE.coil HB 101+(pUBS 520)によって得られる。上記遺伝子はデヒドロゲナーゼについてコード化しておりそして発現プラスミンpKK-117-3HBでクーロン化される。
請求項（抜粋）：
1) 特に有利なNADPH-依存性デヒドロゲナーゼのNADH-特異性を改 善する方法において、補酵素結合領域の酵素の塩基性を遺伝子工学的手段に よってアミノ酸配列を適切に変更することによって低下させることを特徴と する、上記方法。2) 補酵素結合領域のデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の塩基性を正に帯電し たアミノ酸を無帯電のアミノ酸に交換することによって低下させる請求項1 に記載の方法。3) 補酵素結合領域のデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列の塩基性を中性のアミ ノ酸または正に帯電したアミノ酸を負に帯電したアミノ酸に交換することだ けでまたは追加的に交換することで低下させる請求項1または2に記載の方 法。4) 補酵素結合領域に公知のまたは調査できるアミノ酸配列を持つNADPH 優位のデヒドロゲナーゼ生産菌株から出発し、所望の塩基性変更のためにP CR-技術によって関連のDNA-配列を相応して変更しそしてこの方法に よって変更された所望の遺伝子内部の遺伝情報を適当なベクターでクローン 化し、次いでデヒドロゲナーゼ生産微生物中にオバーエクスプレスすること によって、NAD+≧20のkcat/KM値に相当する調剤目的に役立つNA DH-依存性を有するデヒドロゲナーゼを遺伝子工学的方法で製造する請求 項1〜3のいずれか一つに記載の方法。5) N-末端に補酵素結合場所を持つ短鎖のデヒドロゲナーゼを製造する請求 項4に記載の方法。6) アルコール-デヒドロゲナーゼ、特に(R)特異性アルコール-デヒドロ ゲナーゼを製造する請求項5に記載の方法。7) 所望のデヒドロゲナーゼについて符号化して突然変異された、発現プラス ミド中で特にpKK-117-3HB中でクローン化された遺伝子をオーバ ーエクスプレスして含有するE.coil、特にE.coil 101+(pUBS 520)によって デヒドロゲナーゼを製造する請求項4に記載の方法。8) アルコール-デヒドロゲナーゼがLactobacillen、特にL.brevisまたはL.k efirから出発する請求項7に記載の方法。9) Lactobacillus-菌株、特にL.brevisまたはL.kefirから出発し、N-末端 に補酵素結合場所を持つ短鎖のデヒドロゲナーゼのためにコード化された遺 伝子で、補酵素結合場所での所望の塩基性低下に関して相応する遺伝子配列 を変更することによって正に帯電したアミノ酸および/または無帯電アミノ 酸を負に帯電したアミノ酸に交換することによっておよび/または正に帯電 した残基を持つアミノ酸を無帯電の残基を持つアミノ酸に交換することによ って得られる、NAD+≧20のkcat/KM値を有する調剤目的に役立つ( R)-特異性アルコール-デヒドロゲナーゼ。10)L.brevisからのアルコールデヒドロゲナーゼの場合に、無変化では と記載されるN-末端の配列領域で少なくとも1つのG37D-、R38L -、H39L-、K45I-、K45M-および/またはK48M-交換に よって、特に次の一つ によって交換された請求項9に記載のアルコール-ヒドロゲナーゼ。11)相応するケト-化合物の酵素還元によって(R)-ヒドロキシ-化合物を 立体選択的に製造する方法において、酵素として請求項1〜8のいずれか一 つに記載に従って得られるデヒドロゲナーゼを使用することを特徴とする、 上記方法。12)R-ヒドロキシ化合物を酵素酸化することによってラセミ体からS-ヒド ロキシ化合物を立体選択的に製造する方法において、酵素として請求項1〜 8のいずれか一つに記載に従って得られるデヒドロゲナーゼを使用すること を特徴とする、上記方法。
IPC (7件)：
C12N 15/09 ZNA
, C12N 9/14
, C12P 7/02
, C12P 41/00
, C12R 1:19
, C12R 1:24
, C12R 1:225
C12N 9/14
, C12P 7/02
, C12P 41/00 C
, C12R 1:19
, C12R 1:24
, C12R 1:225
, C12N 15/00 ZNA A
