抄録/ポイント：
抄録/ポイント
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ゲノムウォーキングとして知られるゲノム内の既知配列に隣接する領域の解析は現代の遺伝学的な分析において土台となっている。本研究ではPCR依存性で新規なDNAリガーゼであるCircLigaseの特有な環状化性質を基礎とした方向性のある新たなゲノムウォーキングのプトトコルを開発した。最初のステップとして,PCRによるプライマーの伸長を既知配列の境界部分から隣接する領域へと伸びるように設計したリン酸化プライマーを用いて行う。この線状の増幅は一本鎖(ss)DNAを生ずるが,次にこれをCircLigaseにより環状化する。Phi29 DNAポリメラーゼの超分枝化活性を用い,環状ssDNAをローリングサークル増幅により線状化し,二本鎖のコンカテマーDNAを大量に生産する。ネスト化したプライマーを用い,逆PCRにより隣接配列を増幅する。この産物をアガロースゲルで分画し,用いたプライマーの組み合わせのネスト化の位置のために泳動度が変化したバンドを同定し抽出し,配列決定のためにプラスミドベクターにクローン化する。この方法を実験的に確認するため,Pseudomonas sp. LBUM300における2種の抗菌物質整合性遺伝子について適用した。最初の例としてhcnBとphlD遺伝子を用い,約1 kbの隣接配列の単離に成功した。座位特異的なプライマーを用いることにより,ウォーキングの両方向性と特異性を確保し,ランダムプライマーウォーキングプロトコルで典型的に見られる偽のアンプリコンの生成を避けることができる。ここで示したゲノムウォーキングプロトコルはどんな微生物ゲノムにも適用可能であり,ほんの100-150 pbの前配列の情報だけが必要である。ここに提案した方法は制限酵素やアダプター連結などの煩わしいテストを必要としない。これはゲノムウォーキングの目的に新規なリガーゼ酵素CircLigaseを応用して成功した最初の報告である。Copyright 2011 Elsevier B.V., Amsterdam. All rights reserved. Translated from English into Japanese by JST.
