細胞抽出液中のMGMTおよびAPE1活性の大量処理アッセイの進歩

GEORGIADIS Panagiotis; POLYCHRONAKI Nektaria; KYRTOPOULOS Soterios A.

文献

J-GLOBAL ID：201202213891833084 整理番号：12A1117708

細胞抽出液中のMGMTおよびAPE1活性の大量処理アッセイの進歩

Progress in high-throughput assays of MGMT and APE1 activities in cell extracts

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資料名：
巻： 736 号： 1-2 ページ： 25-32 発行年： 2012年08月01日
JST資料番号： C0520A ISSN： 0027-5107 CODEN： MRFMEC 資料種別：逐次刊行物 (A)
記事区分：原著論文発行国：オランダ (NLD) 言語：英語 (EN)

DNA修復活性は遺伝毒性物質に対する個々の感受性の潜在的バイオマーカーとして興味深い。分子疫学プロジェクトの大規模コホート開発の現在の傾向から見て,大量処理,高感度,安価,信頼のおける表現型DNA修復アッセイの開発は緊急を要する。このゴールに向けて著者らは,細胞抽出液中の2つのDNA修復酵素測定用の2つの表現型アッセイを開発し,検証した:(1)O⁶-メチルグアニン-DNA-メチルトランスフェラーゼ(MGMT),遺伝毒性物質によってDNAに誘導された付加物のO⁶-アルキルグアニン型を修復する;(2)アプリン/アピリミジンエンドヌクレアーゼ1(APE1),5’から脱塩基部位へ律速DNA鎖切断を引き起こすことによって塩基除去修復(BER)に関る。MGMTアッセイは次のような事実を利用する:(a)その酵素はアルキル基をグアニンのO⁶位から活性部位のシステイン残基へ不可逆的に転移することによって働き,それによって不活性となる,そして(b)フリー塩基O⁶-ベンジルグアニン(BG)はMGMTの非常に良い基質である。新規アッセイでは,細胞抽出液をビオチン標識BGとインキュベートし,得られたMGMT-BG-ビオチン複合体を抗MGMTコートマイクロタイタープレート上に固定化,その後ストレプトアビジン抱合アルカリホスファターゼと化学発光産生基質を用いて定量化する。APE1活性のワンステップ/ワンチューブ表現型アッセイは,蛍光分子指標(各末端にフルオロホアとクエンチャーを持つヘアピン-ループ構造の部分的自己相補性オリゴヌクレオチド)の利用を基にして開発した。それはまたAPE1によって認識され,切断される単一テトラヒドロフラン残基(THF)を含み,その後に形成される一本鎖オリゴマーは蛍光シグナルエミッターとなる。両アッセイは高感度で,極めて少量の蛋白質抽出液でよく,比較的安価で,容易に自動化できる。それらは広く検証され,大規模分子疫学研究の場で使われている。Copyright 2012 Elsevier B.V., Amsterdam. All rights reserved. Translated from English into Japanese by JST.

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分子遺伝学一般 , 生化学的分析法 , 疫学

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