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J-GLOBAL ID：201602280653623909   整理番号：16A1055103

生細胞におけるCaspase-8の空間分解イメージングのためのチオール-エン・クリック反応を用いた活性局在化蛍光ペプチドプローブの開発

Developing Activity Localization Fluorescence Peptide Probe Using Thiol-Ene Click Reaction for Spatially Resolved Imaging of Caspase-8 in Live Cells

著者 (5件)： LIU Wei (Hunan Univ., Changsha, CHN) ,  LIU Si-Jia (Guangxi Medical Univ., Nanning, CHN) ,  KUANG Yong-Qing (Hunan Univ., Changsha, CHN) ,  LUO Feng-Yan (Hunan Univ., Changsha, CHN) ,  JIANG Jian-Hui (Hunan Univ., Changsha, CHN)
資料名： Analytical Chemistry  (Analytical Chemistry)
巻： 88  号： 15  ページ： 7867-7872  発行年： 2016年08月02日 
JST資料番号： A0395A  ISSN： 0003-2700  CODEN： ANCHAM  資料種別： 逐次刊行物 (A)
記事区分： 原著論文  発行国： アメリカ合衆国 (USA)  言語： 英語 (EN)

抄録/ポイント： 小分子プローブは,生細胞における生物学的事象のモニタリングおよび画像化に有用なツールであり,優れた細胞透過性および生物学的標的に適応性がある。本研究では,生細胞におけるペプチダーゼ活性の空間的に分解した高感度イメージングのために,励起状態分子内光子移動(ESIPT)効果に基づいた活性局在蛍光(ALF)ペプチドプローブを開発した。ALFペプチドプローブは,システイン付加ペプチド基質とアクリロイル化ESIPTフルオロフォア,例えば2-(5’-クロロ-2-ヒドロキシルフェニル)-6-クロロ-4-(3H)-キナゾ-リノン(CHCQ)との容易なチオール-Michakel付加またはチオール-エン・クリック反応に基づいて合成した。ESIPTフルオロフォアの使用により,プローブは,酵素の周囲に局在する多くのフルオロフォアを含む不溶性蛍光凝集体を生成することができ,ペプチダーゼ活性の高感度で高分解能のイメージングをもたらす。このプローブのイメージングCaspase-8活性および生存細胞における局在化への適用性を調べた。3μMのプローブをHeLa細胞と共にRPMI-1640培地中で30分間培養では,蛍光シグナルは認められなかった。対照的に,HeLa細胞を3μMのプローブと共に培養し,40μg/mLのMMCで60分間処理後,明るい緑色の蛍光が細胞内に観察された。40μg/mLのMMCおよび10μMのZ-IETD-FMKで処理した細胞を用いた対照実験も,明るい緑色の蛍光画像を与えず,Caspase-8の蛍光イメージングプローブの特異性を証明した。蛍光画像をより詳細に観察し,ターンオン信号は連続領域ではなく空間的に孤立し高度に局在化したスポットとして現れたことが明らかになった。さらに,z軸を通る異なる切片でのイメージング実験は,細胞質内で密に分布しているが空間的に分離した蛍光スポットを与えた。細胞におけるCaspase-8活性化のリアルタイムモニタリングを行った。20μg/mLのMMCで処理した細胞では,30分でCaspase-8の顕著な活性化は観察されなかったが,45分後に実質的なCaspase-8活性が見られた。この時点で,Mitotrackerredによる蛍光染色は,ミトコンドリアが分裂した糸状構造,外部膜の透過化を伴わないミトコンドリアの典型的な形態のままであった。この知見は,Caspase-8活性化が,MMC誘導性のHeLa細胞のアポトーシスにおけるミトコンドリア外膜透過化(MOMP)よりも早く起こる事象であることを示唆した。時間が120分に増すにつれ,Caspase-8活性化の増強された蛍光シグナルが細胞の付随した収縮と共に達成された。ミトコンドリア膜電位のわずかな喪失および細胞アポトーシス進行の指標として,MitotrackerRedの蛍光コントラストがわずかに低下したミトコンドリアの断片化した泡様形態のわずかな部分が60分以降現れた。これらの結果は,MMC誘発アポトーシスにおいて,Caspase-8活性化が,外因性アポトーシス経路の典型的な時間的順序であるMOMPよりもずっと早く起こったことを示唆した。この結果はまた,MMC処理されたHeLa細胞における外因性アポトーシス経路の支配的役割を示し,これは他の細胞株に関する以前の所見と一致した。濃度を増加させたMMCで1時間処理した細胞を調べ,明確な用量依存性蛍光活性化が観察された。MMCの用量を増加させると,より高いCaspase-8酵素活性が誘導されることが報告されており,これらの結果は,生細胞におけるCaspase-8活性の定量的イメージングのためのALFプローブの可能性を示唆した。

シソーラス用語： *細胞 ,  *カスパーゼ ,  *空間 ,  *画像処理 ,  エン反応 ,  化学合成 ,  活性 ,  改変 ,  *蛍光 ,  ペプチド ,  *プローブ ,  開発 ,  ペプチダーゼ ,  プロトン移動 ,  発色団 ,  HeLa細胞 ,  膜電位 ,  アポトーシス ,  生細胞 ,  カスパーゼ8 ,  チオール-エン反応 ,  ミトコンドリア膜電位 ,  クリック化学 ,  励起状態分子内プロトン移動 ,  発蛍光団
準シソーラス用語： イメージング ,  クリック反応 ,  局在化 ,  ESIPT ,  フルオロホア

分類 (3件)： 生物科学研究法一般  (EA03010K) ,  蛋白質・ペプチド一般  (EB03010N) ,  分析機器  (CC02020S)

タイトルに関連する用語 (9件)： 生細胞 ,  分解 ,  イメージング ,  チオール ,  クリック反応 ,  活性 ,  局在化 ,  蛍光 ,  開発