抄録/ポイント：
抄録/ポイント
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【背景】緑膿菌は,クオラムセンシング,バイオフィルム形成,および免疫不全患者における院内感染の主要原因の研究のためのモデル生物である。このような緑膿菌は遺伝学の観点から最も良く研究された生物の一つである。しかしながら,緑膿菌における遺伝子欠失および置換の構築は,比較的時間がかかり,自殺ベクター構築,抱合,抗生物質耐性カセットの挿入による不活性化および対立遺伝子交換を含む複数のステップを必要とする。直接変換によるゲートウェイ再結合技術を採用しても,最小2週間を必要とする。【方法】著者らは,直接形質転換を通して緑膿菌における清浄な欠失突然変異体を作り出すための迅速な流線型法を開発し,Gateway適合性自殺ベクターの作成の必要性を排除した。この方法では,削除される遺伝子/遺伝子座の上流および下流配列をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅し,Gibson集合により線形化pEX18Tc sacB自殺プラスミドとシームレスに融合した。本研究で最適化したエレクトロポレーション法により,得られた欠失プラスミドを緑膿菌に形質転換した。次に,プラスミドを相同組換えにより染色体に組み込み,欠失変異体をsacB仲介スクロース対選択により同定した。【結果】現在の方法を用いて,ヘム同化系抗σ因子,HassおよびECF系抗σおよびσ因子vreAおよびvreIを含む病原性調節因子のクリーンな遺伝子欠失を発生させた。遺伝子欠失のDNA配列決定によるプラスミド構築から確認までの過程を1週間で完了した。さらに,この方法の有用性をvreAとvreI欠失の構築において強調し,そこではvreAの開始コドンとvreI重複の終止コドンが重なる。Gibson集合欠失突然変異体を用いて,それぞれのvreAおよびvreI欠失を生成するために単一塩基対精度で構築し,一方,それぞれの遺伝子の開始および終止コドンを維持した。全体として,この方法は,塩基対精度を持つ緑膿菌における遺伝子欠失の迅速な構築を可能にする。【結論】自殺ベクターの構築から非標識遺伝子欠失の配列確認までのこの方法は,高価な固有の試薬または器具に対する要求なしで,1週間で実行することができる。Gibson集合の精度と望ましい構築物の生成における精度は95%であり,これを以前の方法に対する実行可能で魅力的な代替案とした。Copyright 2018 The Author(s). All rights reserved. Translated from English into Japanese by JST.【JST・京大機械翻訳】
