抄録/ポイント：
抄録/ポイント
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【目的】MTB生菌および熱不活性化菌の同定のための,改良モノアジドプロピジウム(PMAxx)-蛍光定量的PCR(qPCR)法を確立する。PMAxx-qPCRによる抗結核薬のinvitro活性測定の価値を検討する。【方法】MTB株H37Rvに対するPMAxxの前処理条件を,曝露時間,暗インキュベーション時間,PMAxx濃度,および標的DNAフラグメント長を含む,生菌および熱不活性化菌によって最適化した。【方法】イソニアジド(INH)とリファンピシン(RFP)のinvitro抗菌活性を,用量効果曲線と循環閾値(Cq)と細菌負荷の検量線をプロットすることによって,PMAxx-qPCRによって測定し,そして,検出感度を評価した。また、それぞれマイクロプレートAlamarBlue(MABA)法とコロニー形成単位(CFU)計数法と比較し、コロニー計数は独立サンプルt検定を用いて統計分析を行い、P<0.05は統計学的に有意な差があった。結果:細菌負荷が107CFU/mlに設定された時,PMAxx濃度が10μmol/L,暗いインキュベーション10分後に15分間暴露後,生菌,死菌(△Cq死-活=6.772±0.453)を有効に識別できた。また、>200bpの標的断片を用いて、生菌、死菌の差異をより有効に反映できる。PMAxx-qPCR法は薬物作用後3dにMABA法との一致性がよい最小発育阻止濃度(MIC)検査結果(INH)が得られた。0.0490.076μg/mlと0.0320.064μg/ml,t=0.782,P=0.491;RFP;0.1020.145μg/mlと0.0510.079μg/ml(t=2.828,P=0.066)。検量線Cqは,細菌計数(lgCFU/ml)と良好な直線性を示し(R2=0.9863),検出限界は102CFU/mlであり,PMAxx-qPCR法とCFU計数法は,16×MIC,8×MIC,および16×MICであった。4×MIC,2×MICおよび1×MIC濃度のINHの抗菌計数は,それぞれ(4.376±0.344)および(4.325±0.318),(4.232±0.106)および(3.936±0.194),(4.122±0.)であった。277)と(3.874±0.105),(3.950±0.113)と(3.675±0.250),(3.770±0.228)と(3.618±0.257)CFU/mlであった。2つの方法の統計的有意差は認められなかった(t=0.165,1.894,1.186,1.419および0.626,P=0.880,0.199,0.357,0.292および0.595)。8×MIC,4×MIC,2×MICと1×MICのRFPの抗菌計数は,それぞれ(4.577±0.216)と(4.675±0.250),(4.445±0.054)と(4.374±0.675),(3であった。627±0.173と(3.154±0.076),(1.946±0.359)と(2.159±0.083),(1.552±0.423)と(0.960±0.202)CFU/mlであった。2つの方法の統計的有意差は認められなかった(t値は0.469,0.199,3.535,0.784,1.777,P値はそれぞれ0.671,0.855,0.071,0.490,0.174)。結論:確立したPMAxx-qPCR法は安定であり、一線抗結核薬INHとRFPの活性測定に応用でき、感度が高く、かつ迅速で正確である。Data from Wanfang. Translated by JST.【JST・京大機械翻訳】
