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J-GLOBAL ID：200903017637488800

好熱酵素を用いる鎖置換増幅法

Inventor： メリンダ・エス・フレイザー ,  キャサリン・エイ・スパーゴー ,  ジョージ・テランス・ウォーカー ,  マーク・ヴァン・クリーブ ,  デービッド・ジェームズ・ライト
Applicant, Patent owner： ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー
Agent (1)： 湯浅 恭三 (外6名)
Gazette classification：公開公報
Application number (International application number)：1995088242
Publication number (International publication number)：1995289298
Application date： Apr. 13, 1995
Publication date： Nov. 07, 1995
Summary：

【要約】【目的】 好熱性ポリメラーゼおよび好熱性制限エンドヌクレアーゼの両方が同一の反応混合物中で効率的に機能する等温鎖置換増幅法(好熱SDA)の温度条件および反応条件を提供する。【構成】 本発明は、通常のSDAより広い温度範囲(37-70°C)で実施しうる好熱SDAを提供する。好熱SDAに好ましい温度範囲は50-70°Cである。特定の好熱性制限エンドヌクレアーゼがSDAに要求される半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位をニックし、次いでその部位から解離しうることが見出された。さらに特定の好熱性ポリメラーゼはそのニックから伸長させ、一方では下流の鎖を置換しうることが見出された。これらの知見から、好熱SDAは通常のSDA酵素系につき従来可能であったものより高い温度で実施しうるため、向上した特異性および効率、減少した非特異的バックグラウンド増幅、ならびに潜在的に向上した増幅生成物収率を有する。さらに、変性温度で安定な酵素を用いる場合、二本鎖標的の初期の熱変性後に別個の工程で酵素を添加する必要性が除かれる。

Claim (excerpt)：

標的配列を増幅するための下記を含む方法:a)標的配列を含む一本鎖核酸フラグメントを用意し、該フラグメントは5′末端および3′末端を有し;b)SDAのための増幅プライマーを該フラグメントの3′末端に、該プライマーが5′側一本鎖オーバーハングを形成するように結合させ、該増幅プライマーは標的核酸配列を切断しない好熱性制限エンドヌクレアーゼに対する認識/開裂部位を含み;c)フラグメント上の増幅プライマーを下記の存在下に伸長させ:i)好熱性DNAポリメラーゼ;該ポリメラーゼは約50-70°Cにおいて活性であり、鎖置換活性を有し、かつ5′-3′エキソヌクレアーゼ活性を欠如する、ii)デオキシヌクレオシドトリホスフェート、iii)少なくとも1種類の誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェート、およびiv)前記の認識/開裂部位が誘導デオキシヌクレオシドトリホスフェートの取り込みにより半修飾された場合に該部位をニックする、好熱性制限エンドヌクレアーゼ;該エンドヌクレアーゼは約50-70°Cにおいて活性である、これにより、標的配列に対して相補的な新たに合成された第1鎖、および二本鎖状の半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位を含む、増幅プライマーの第1伸長生成物を産生させ;d)この二本鎖状の半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識/開裂部位を制限エンドヌクレアーゼによりニックし;e)このニックからDNAポリメラーゼにより伸長させ、これにより前記の新たに合成された第1鎖をフラグメントから置換し、そして新たに合成された第2鎖を含む第2伸長生成物を生成させ、そして;f)このニッキング、伸長および置換の工程を反復して、これにより標的配列を増幅する。

IPC (4)：

C12Q 1/68 ,  C12N 9/12 ,  C12N 9/16 ,  C12N 15/09 ZNA

Patent cited by the Patent：

Cited by examiner (1)

• 核酸標的物の生成法
  Gazette classification：公開公報   Application number：特願平4-310521   Applicant：ベクトン・ディッキンソン・アンド・カンパニー