標的分子と相互作用する(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子の同定方法

Inventor： , ,
Applicant, Patent owner：
Agent (1)：青山葆 (外1名)
Gazette classification：公表公報
Application number (International application number)：1998545038
Publication number (International publication number)：2001521395
Application date： Apr. 23, 1998
Publication date： Nov. 06, 2001
Summary：

【要約】本発明は、標的分子と相互作用する(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子を同定する方法に関する。本発明の方法は、特に、ssrA-RNAのtag-コード配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの存在下、ポリソームを形成することが可能な条件下でのインビトロ翻訳工程によって特徴づけられる。本発明はさらに、本発明を実行するのに有用なキットに関する。

Claim (excerpt)：

1. 標的分子と相互作用する(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子を同定する方法であって、(a)正確なリーディングフレームにおける終止コドンを欠くmRNAの集団を、インビトロ翻訳システムにおいて翻訳する工程であって、該翻訳システムは、ポリソームの形成が可能な条件下で、ssrA-RNAのtag-配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むか、またはssrA-RNAを含まない工程;(b)形成したポリソームを前記標的分子と、前記mRNA分子によりコードされ該ポリソームによってディスプレイされる(ポリ)ペプチドと前記標的分子との相互作用が可能な条件下で、接触させる工程;(c)前記標的分子と相互作用する(ポリ)ペプチドをディスプレイするポリソームを、そのような(ポリ)ペプチドをディスプレイしていないポリソームから分離する工程;および(d)前記標的分子と相互作用するポリソームにおいてディスプレイされた(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子を同定する工程を含む方法。 2. 前記mRNA分子が3'末端にステムループを含む、請求項1記載の方法。 3. 57〜116個のアミノ酸を優先的にコードするスペーサーを(ポリ)ペプチドのリーディングフレームに融合して、リボソームの推定(ポリ)ペプチドチャネルへ折り畳まれた新生の(ポリ)ペプチドを繋ぎ留める、請求項2記載の方法。 4. 前記mRNA分子の3'末端の前記ステムループが、前記スペーサーをコードしている、請求項2記載の方法。 5. 前記RNA分子が、5'末端のステムループ構造を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 6. 前記インビトロ翻訳システムが、リボヌクレアーゼの阻害剤を含有する請求項1〜4のいずれかに記載の方法。 7. 前記リボヌクレアーゼの阻害剤がトランジション段階のアナログである、請求項6記載の方法。 8. 前記トランジション段階のアナログがバナジルリボヌクレアーゼ複合体である、請求項7記載の方法。 9. (a)ポリソームの形成後のマグネシウム塩、好ましくは酢酸マグネシウムの添加;および/または(b)mRNAと対応する(ポリ)ペプチドとの間の架橋を形成させる手段;および/または(c)翻訳の後および/またはスクリーニング過程の間の低い温度によってポリソームが工程(a)〜(c)において安定化されている、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 10. 翻訳システムが原核生物の翻訳システムである、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 11. 翻訳システムが真核生物の翻訳システムである、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。 12. 工程(d)が、(da)前記mRNAを逆転写し;(db)場合により、得られたcDNAを増幅し;(dc)場合により、場合により増幅したcDNAをクローニングし;そして(dd)前記cDNAの配列を決定することを含む、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。 13. 工程(a)の前に還元剤の存在下にDNAをmRNAに転写する、請求項1〜12のいずれかに記載の方法。 14. 還元剤を工程(a)の前に除去する、請求項13記載の方法。 15. 以下の工程:(a)正しいリーディングフレームにおける終止コドンを欠くDNA分子の集団を、還元剤の存在下でmRNAの集団に転写すること;(b)mRNA分子のこの集団から前記還元剤を除去すること;(c)ポリソームの形成を可能する条件下で、インビトロ翻訳システムにおいてmRNA分子の前記集団を翻訳すること;(d)前記mRNA分子によってコードされ前記ポリソームによってディスプレイされる(ポリ)ペプチドと前記標的分子との相互作用を可能にする条件下で、形成したポリソームを前記標的分子と接触させる工程;(e)そのような(ポリ)ペプチドをディスプレイしていないポリソームから、前記標的分子と相互作用する(ポリ)ペプチドをディスプレイしているポリソームを分離すること;および(f)前記標的分子と相互作用するポリソームにおいてディスプレイされた(ポリ)ペプチドをコードしている核酸分子を同定することを含む標的分子と相互作用する(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子を同定するための方法。 16. 還元剤が、β-メルカプトエタノールおよび/またはDTTである、請求項13〜15のいずれかに記載の方法。 17. (ポリ)ペプチドが、免疫グロブリンスーパーファミリー、好ましくは免疫グロブリンファミリーの領域を含む、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。 18. (ポリ)ペプチドが一本鎖の抗体である、請求項17記載の方法。 19. ジスルフィドイソメラーゼまたは還元されたグルタチオン、E.coliDsbA、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも1つの化合物が翻訳システムに添加されている、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。 20. ポリソームどうしの、および/またはポリソームと標的分子との間の、および/または場合によりポリソームと標的分子が固定化されるマトリックスとの間の、ポリソームと前記標的分子と接触させる工程の間に形成した非特異的な相互作用をブロッキング化合物の添加によって阻害または減少させる、請求項1〜19のいずれかに記載の方法。 21. 前記ブロッキング化合物がヘパリンまたは滅菌されたミルクである、請求項20記載の方法。 22. (a)ssrA-RNAのtag-コード配列似相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド;(b)場合により、スクリーニングされる(ポリ)ペプチドをコードする核酸をクローニングするための適当なベクター;(c)場合により、リボヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは翻訳段階のアナログ、および最も好ましくはバナジルリボヌクレオシド複合体;(d)場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化されたまたは還元されたグルタチオン、E.coliタンパク質DsbA、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも1つの化合物;および(e)場合により、5'または3'ステムループをコードするオリゴヌクレオチド、スペーサーまたは終止コドンを有しないターミネーターを含むキット。 23. さらに、(f)S-30翻訳抽出物(g)PCR構成成分(h)逆転写酵素(i)RNA配列決定キット(j)DNA配列決定キットを含む、請求項22記載のキット。 24. (a)ssrA-RNAを含まないインビトロ無細胞翻訳抽出物(b)場合により、スクリーニングされる(ポリ)ペプチドをコードする核酸をクローニングするための適当なベクター;(c)場合により、リボヌクレアーゼ阻害剤、好ましくは翻訳段階のアナログ、および最も好ましくはバナジルリボヌクレオシド複合体;(d)場合により、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、酸化されたまたは還元されたグルタチオン、E.coliタンパク質DsbA、および分子シャペロンからなる群から選択される少なくとも1つの化合物;および(e)場合により、5'または3'ステムループをコードするオリゴヌクレオチド、スペーサーまたは終止コドンを有しないターミネーターを含むキット。 25. さらに、(f)PCR構成成分(g)逆転写酵素(h)RNA配列決定キット(i)DNA配列決定キットを含む、請求項24記載のキット。

IPC (2)：

C12N 15/09 , C07K 16/18

FI (2)：

C07K 16/18 , C12N 15/00 A

Article cited by the Patent：

Cited by applicant (2)

Cited by examiner (2)

Return to Previous Page