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J-GLOBAL ID：200903055015424545

バックグランドノイズの減少を伴う液相核酸サンドイッチアッセイ

Inventor： アーデア, マイケル エス. ,  フルツ, ティモシー ,  ワーナー, ブライアン ディー. ,  コリンズ, マーク
Applicant, Patent owner： カイロン コーポレイション
Agent (1)： 山本 秀策
Gazette classification：公表公報
Application number (International application number)：1995516343
Publication number (International publication number)：1997507024
Application date： Dec. 07, 1994
Publication date： Jul. 15, 1997
Summary：

【要約】液相ハイブリダイゼーションアッセイにおいて生じるバックグランドシグナルを、本質的に減少する新規の技術が提供される。この技術は、目的の標的ポリヌクレオチドの存在下においてのみ生成される検出可能なシグナルを提供するように、非特異的ハイブリダイゼーションおよび非特異的結合の現象を排除するまたは有意に減少することを前提とする。ある実施態様では、シグナルを増大する方法が提供され、それ以外のシグナルは、ノイズの低下で減少する。新規アッセイを行うためのキットも提供される。

Claim (excerpt)：

1. サンプル中の核酸分析物を検出するための液相におけるサンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって:(a)該分析物を直接的または間接的に固体支持体に結合すること;(b)該分析物を標識すること;および(c)該分析物結合標識の存在を検出することを包含し、 改良点として、第1の捕獲エキステンダー分子および別の第2の捕獲エキステンダー分子をアッセイ内に組み込むことを包含し、該第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子が、それぞれ、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメント、および固体支持体に結合する捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含み、 ここで、該第1の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントが、該第2の捕獲エキステンダー分子の該分析物結合セグメントと区別され、さらにここで、2つの別の該捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得るように、該捕獲プローブが、該第1の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、該第2の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを含む、アッセイ。2. 請求項1に記載のアッセイであって、前記核酸分析物が、前記捕獲プローブと、前記捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成されるハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5°C高い、アッセイ。3. 請求項2に記載のアッセイであって、少なくとも1つの工程が、Tm1複合体形成には好ましいが、Tm2複合体形成には好ましくないストリンジェンシー条件下で行われる、アッセイ。4. 請求項3に記載のアッセイであって、ストリンジェンシーが、ホルムアミド濃度、カオトロピックな塩濃度、塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒成分、および温度からなる群より選択される、少なくとも1つの工程のパラメーターを制御することによって制御される、アッセイ。5. 請求項4に記載のアッセイであって、少なくとも1つの前記工程がTm2よりも高くおよびTm1よりも低い温度で行われる、アッセイ。6. 請求項3に記載のアッセイであって、少なくとも1つの前記工程が工程(a)を包含する、アッセイ。7. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列M-1を含む標識プローブシステムとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共にハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および (e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (f)該標識された支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、 ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5°C高い、アッセイ。8. 請求項7に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、(i)核酸配列M-1と、標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一のオリゴヌクレオチドサブユニットとを含有する増幅マルチマー、および(ii)M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列L-3を含む標識プローブを含有し、ここで、該アッセイの工程(d)は、以下の工程: (d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成する工程; (d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および (d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させ、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;を包含する、アッセイ。9. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントC-1および該捕獲プローブの核酸配列にハイブリダイズし得る第2のセグメントC-2を有する捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイアープローブの核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーと結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1と標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一のオリゴヌクレオチドサブユニットとを含む増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイゼーション条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること; (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)該支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、 ここで、該核酸分析物が、該捕獲プローブと、該捕獲エキステンダー分子と、該核酸分析物との間で形成される該ハイブリッド複合体の該捕獲プローブから解離する融解温度Tm1が、該捕獲プローブと捕獲エキステンダー分子との間で形成されるハイブリッド複合体の融解温度Tm2よりも少なくとも約5°C高い、アッセイ。10. 請求項7に記載のアッセイであって、少なくとも1つの工程が、Tm1複合体形成には好ましいが、Tm2複合体形成には好ましくないストリンジェンシー条件下で行われる、アッセイ。11. 請求項10に記載のアッセイであって、ストリンジェンシーが、ホルムアミド濃度、カオトロピックな塩濃度、塩濃度、pH(水素イオン濃度)、有機溶媒成分、および温度からなる群より選択される、少なくとも1つの工程のパラメーターを制御することによって制御される、アッセイ。12. 請求項11に記載のアッセイであって、少なくとも1つの前記工程がTm2よりも高く、そしてTm1よりも低い温度で行われる、アッセイ。13. 請求項10に記載の方法であって、少なくとも1つの前記工程が工程(b)を包含する、アッセイ。14. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1および第2のセグメントL-2を有する標識エキステンダー分子と、L-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体を該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、 ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体が形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。15. サンプル中の核酸分析物の存在を検出する液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって: (a)固体支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する第1の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分解物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含むポリヌクレオチドを含有する別の第2の捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントL-1およびプリアンプリファイアープローブ中の核酸配列P-1にハイブリダイズし得る第2のセグメントL-2を有する標的エキステンダー分子と、核酸配列P-1を有し、そして核酸配列P-2を介して多数の増幅マルチマーに結合し得るプリアンプリファイアープローブと、P-2にハイブリダイズし得る核酸配列M-1および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含む多数の同一なオリゴヌクレオチドサブユニットを含有する増幅マルチマーと、M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる配列L-3を含む標識プローブとを提供すること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合した第1のハイブリッドの複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体と該プリアンプリファイアープローブおよび該増幅マルチマーとを接触させて、支持体に結合した第2のハイブリッド複合体を生成すること; (e)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (f)ハイブリダイズする条件下で、該支持体に結合した第2のハイブリッド複合体と該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合した第3のハイブリッド複合体を生成すること;および (g)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (h)支持体に結合した第3のハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し、 ここで、第1のおよび第2の捕獲エキステンダー分子の両方が該分析物に結合している場合にのみ、工程(b)の該支持体に結合した第1のハイブリッド複合体が形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。16. 請求項14に記載のアッセイであって、前記捕獲プローブが、前記第1の捕獲エキステンダー分子の前記支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、前記第2の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを含有し、そのような2つの捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得る、アッセイ。17. 請求項15に記載の方法であって、前記捕獲プローブが、前記第1の捕獲エキステンダー分子の前記支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第1の捕獲エキステンダー結合配列と、前記第2の捕獲エキステンダー分子の該支持体結合セグメントにハイブリダイズし得る第2の捕獲エキステンダー結合配列とを含有し、そのような2つの捕獲エキステンダー分子が単一の捕獲プローブに結合し得るアッセイ。18. サンプル中の核酸分析物の存在を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する第1の標識エキステンダー分子と、該分析物中の核酸配列にハイブリダイズし得る第1のセグメントおよび標識プローブシステムにハイブリダイズし得る第2のセグメントを有する別の第2の標識エキステンダー分子と、該第1の標識エキステンダー分子および該第2の標識エキステンダー分子の該第2のセグメントにハイブリダイズし得る核酸配列を含む標識プローブシステムを提供し、そしてこのプローブシステムが直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じること; (b)該固体支持体上で、同時にまたは任意の順序で連続して、該捕獲エキステンダー分子、標識エキステンダー分子、および該捕獲プローブと共に、ハイブリダイゼーション条件下で、該核酸分析物をインキュベートして、支持体に結合したハイブリッド複合体を形成すること; (c)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離すること; (d)次いで、ハイブリダイズする条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と標識プローブシステムとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成すること;および (e)次いで、該固体支持体に結合しない物質を分離すること;および (f)該標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体の標識の存在を検出すること;を包含し ここで、第1のおよび第2の標識エキステンダー分子の両方が該分析物に結合した場合にのみ、工程(d)の該標識され、該支持体に結合したハイブリッド複合体を形成するように、該捕獲エキステンダー分子が設計される、アッセイ。19. 請求項18に記載のアッセイであって、前記標識プローブシステムが、(i)前記第1の標識エキステンダー分子および前記第2の標識エキステンダー分子の前記第2のセグメントにハイブリダイズし得る前記核酸配列を含有する増幅マルチマー、および標識プローブにハイブリダイズし得る核酸配列M-2を含有する多くの同一なオリゴヌクレオチドサブユニット、および(ii)M-2にハイブリダイズし得、そして直接的または間接的に、検出可能なシグナルを生じさせる核酸配列L-3を含有する標識プローブを含み、そしてここで、該アッセイの工程(d)は、以下の工程: (d1)ハイブリダイゼーション条件下で該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該増幅マルチマーとを接触させて、第2の支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程; (d2)次いで、必要に応じて、該固体支持体に結合しない物質を分離する工程;および (d3)次いで、ハイブリダイゼーション条件下で、第2の該支持体に結合したハイブリッド複合体と、該標識プローブとを接触させて、標識され、支持体に結合したハイブリッド複合体を生成する工程;を包含する、アッセイ。20. サンプル中の核酸分析物の存在を検出するための液相サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイであって: (a)支持体上に捕獲プローブを有する固体支持体と、該分析物中に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る分析物結合セグメントおよび該捕獲プローブ内に存在する核酸配列にハイブリダイズし得る支持体結合セグメントを含有するポリヌクレオチドを含む捕獲エキステンダー・・・

IPC (5)：

C12N 15/09 ZNA ,  C12Q 1/68 ,  G01N 33/53 ,  G01N 33/543 515 ,  G01N 33/566

FI (5)：

C12N 15/00 ZNA A ,  C12Q 1/68 A ,  G01N 33/53 M ,  G01N 33/543 515 B ,  G01N 33/566