核酸鎖の解析方法

Inventor：
Applicant, Patent owner：
Agent (3)：田村恭生 , 高山裕貢 , 齋藤みの里
Gazette classification：公表公報
Application number (International application number)：2002585662
Publication number (International publication number)：2004529650
Application date： Apr. 26, 2002
Publication date： Sep. 30, 2004
Summary：

本発明は、核酸鎖を解析する方法に関する。本方法の基礎は、ポリメラーゼにより伸長中の核酸鎖に組み込まれた、色素で標識された個々のヌクレオチド分子の蛍光シグナルの検出である。反応は平面的表面上で行われる。個々の核酸分子が非常に多く該表面に固定化されている。これらの核酸分子はすべて同じ条件下にあり、それ故合成反応をすべての核酸分子において同時に行うことができる。

Claim (excerpt)：

全体配列の重複部分配列に相当し得る長さ約50-1000ヌクレオチドの一本鎖核酸配列(核酸鎖、NACs)の断片(NACFs)を形成し、該NACFsを、1つの均一またはいくつかの相異なるプライマーを用いるNACFプライマー複合体の形で、反応表面上にランダムな配置で結合し、以下のステップa)からf)を適すれば数回繰り返すことにより、NACFsの相補鎖の周期的合成反応を一つまたはそれ以上のポリメラーゼを使用して実行し、連続的サイクルのステップd)において各々の位置で検出された蛍光シグナルをNTsに具体的に割り当てることにより、反応表面上の個々のNACFプライマー複合体の相対的位置およびこれらNACFsの配列を決定する、 NACsの並行配列解析方法: a) 表面上に結合したNACFプライマー複合体に、一つまたはそれ以上のポリメラーゼ、および蛍光色素で標識された一つから四つの修飾ヌクレオチド(NTs*)であって、少なくとも二つのNTs*を併用した場合に相異なる蛍光シグナルを測定することにより使用したNTs*を互いに区別できるようにそのNTs*に存在する蛍光色素が選択されており、伸長中の相補鎖におけるこのようなNTs*の組み込みに続いてポリメラーゼが同じ鎖にさらにNT*を組み込むことができないようにその塩基において構造的に修飾されており、その蛍光色素が切断可能であり、およびその構造的修飾が切断可能な立体要求リガンドであるNTs*を含む溶液を添加し、 b) ステップa)で得られた固定相を、相補鎖を伸長するのに適した条件下でインキュベートし、その相補鎖をいずれの場合にも1NT*ずつ伸長させ、 c) ステップb)で得られた固定相を、相補鎖に組み込まれなかったNTs*を除去するのに適した条件下で洗浄し、 d) それぞれの蛍光色素に特徴的なシグナルを測定することにより相補鎖に組み込まれた単一NTs*を検出し、同時に個々の蛍光シグナルの反応表面上の相対的位置を測定し、 e) 非標識(NTsまたは)NACFsを形成するため、相補鎖に添加したNTs*の蛍光色素および立体要求リガンドを切断除去し、 f) ステップe)で得られた固定相を、蛍光色素およびリガンドを除去するのに適した条件下で洗浄する。

IPC (7)：

C12N15/09 , C07H19/10 , C12M1/00 , C12Q1/48 , C12Q1/68 , G01N21/78 , G01N33/58

FI (7)：

C12N15/00 F , C07H19/10 , C12M1/00 A , C12Q1/48 Z , C12Q1/68 A , G01N21/78 C , G01N33/58 A

F-Term (42)：

2G045AA35 , 2G045DA13 , 2G045FB02 , 2G045FB12 , 2G045GC15 , 2G054CA22 , 2G054CE02 , 2G054EA03 , 4B024AA11 , 4B024AA19 , 4B024AA20 , 4B024CA01 , 4B024CA20 , 4B024HA08 , 4B024HA11 , 4B029AA07 , 4B029AA23 , 4B029BB20 , 4B029CC03 , 4B029FA15 , 4B063QA12 , 4B063QA13 , 4B063QQ42 , 4B063QR08 , 4B063QR22 , 4B063QR32 , 4B063QR41 , 4B063QR42 , 4B063QR62 , 4B063QR66 , 4B063QR82 , 4B063QS03 , 4B063QS16 , 4B063QS25 , 4B063QS34 , 4B063QX02 , 4C057BB02 , 4C057CC03 , 4C057DD03 , 4C057LL11 , 4C057LL19 , 4C057LL22

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