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J-GLOBAL ID：200903086453580854

末端反復増幅方法

Inventor： ソークナナン,ロイ ,  マレツク,ローレンス
Applicant, Patent owner： アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Agent (1)： 川口 義雄 (外3名)
Gazette classification：公表公報
Application number (International application number)：1996518184
Publication number (International publication number)：1998510161
Application date： Nov. 28, 1995
Publication date： Oct. 06, 1998
Summary：

【要約】本発明は、比較的一定の温度で、試薬を連続的に加えることなく、特定核酸配列を増幅する方法に関する。この方法は、単一の反応媒体中に、RNAポリメラーゼ、DNAポリメラーゼ、一本鎖もしくは二本鎖のRNAもしくはDNAを加水分解することなくRNA-DNAハイブリッドのRNAを加水分解するリボヌクレアーゼ、ならびにリボヌクレシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を加えるものである。この方法は次に、反応媒体中にRNA第1鋳型を加えるものである。RNA第1鋳型は、特定核酸配列に対して相補的な配列、RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列、ならびに少なくとも開始部位のマイナスセンス配列に対して相補的である5’末端配列を有してなる。そうして、RNA第1鋳型は、5’末端ステム-ループ構造に折り畳まれ得る逆反復配列を有する。DNAポリメラーゼはRNA第1鋳型を用いて、共にRNA-DNAハイブリッドを有してなるDNA第2鋳型を合成する。DNA第鋳型は、プロモーターおよび開始部位のプラスセンス配列と、開始部位のプラスセンス配列に対して相補的な3’末端プライミング配列を有する。次に、リボヌクレアーゼがRNA-DNAハイブリッドを形成するRNAを加水分解することで、3’末端プライミング配列がDNA第2鋳型の開始部位のプラスセンス配列にハイブリッド形成することができる。次に、DNAポリメラーゼがDNA第2鋳型を用いて、DNA第2鋳型の3’末端プライミング配列を延長することによってプロモーターを合成する。得られる部分てきに二本鎖のDNAは、ステム-ループ構造の頂点方向に配向したプロモーターを有する。次に、RNAポリメラーゼがプロモーターの認識およびDNA第2鋳型の転写を行うことで、RNA第1鋳型のコピーを提供する。その後、この方法では、特定核酸配列またはそれの補体の所望の増幅を行うのに十分な時間にわたり、反応条件を維持する。本発明は、本発明の試薬を含むキットを包含するものである。

Claim (excerpt)：

比較的一定の温度で、試薬を連続的に加えることなく、特定核酸配列を増幅する方法であって、 (A)(i)第1のオリゴヌクレオチドプライマー、 (ii)RNAポリメラーゼ、 (iii)DNAポリメラーゼ、 (iv)一本鎖もしくは二本鎖のRNAもしくはDNAを加水分解することなくRNA-DNAハイブリッドのRNAを加水分解するリボヌクレアーゼ、ならびに (v)リボヌクレシド三リン酸およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸 を有してなる試薬を含む単一の反応媒体を提供する段階; (B)前記特定核酸配列に対して相補的な配列、前記RNAポリメラーゼによって認識されるプロモーターおよび開始部位のマイナスセンス配列、ならびに少なくとも前記開始部位の前記マイナスセンス配列に対して自己相補的である5’末端配列を有してなるRNA第1鋳型を有してなるRNAを前記反応媒体中に提供する段階であって、 (i)前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーが前記RNA第1鋳型にハイブリッド形成し、 (ii)前記DNAポリメラーゼが前記RNA第1鋳型を用いて、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーを延長することでDNA第2鋳型を合成し、それによってRNA-DNAハイブリッドを形成し、前記DNA第2鋳型は前記プロモーターおよび前記開始部位のプラスセンス配列ならびに前記開始部位の前記プラスセンス配列に対して自己相補的である3’末端プライミング配列を有してなるものであり、 (iii)前記リボヌクレアーゼが前記RNA-DNAハイブリッドを形成するRNAを加水分解し、 (iv)前記DNA第2鋳型の前記3’末端プライミング配列が前記開始部位の前記プラスセンス配列にハイブリッド形成し、 (v)前記DNAポリメラーゼが前記DNA第2鋳型を鋳型として用いて、前記DNA第2鋳型の延長によって前記プロモーターを合成し、 (vi)前記RNAポリメラーゼがプロモーターの認識およびDNA第2鋳型の転写を行うことで、前記RNA第1鋳型のコピーを提供する サイクルが行われるような条件下で行われる前記段階;ならびにそれ以降、 (C)前記特定核酸配列の所望の増幅を行うのに十分な時間、前記条件を維持する段階 を有してなる方法。

IPC (2)：

C12N 15/09 ZNA ,  C12Q 1/68

FI (2)：

C12N 15/00 ZNA A ,  C12Q 1/68 A