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J-GLOBAL ID：200903098047468677

組重ね式複製連鎖反応を用いる核酸の標的セグメントの増幅の改良方法

Inventor： グロズ,ロン ,  ジエンセン,マーク・アントン
Applicant, Patent owner： イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Agent (1)： 小田島 平吉 (外1名)
Gazette classification：公表公報
Application number (International application number)：1994514246
Publication number (International publication number)：1996504332
Application date： Dec. 08, 1993
Publication date： May. 14, 1996
Summary：

【要約】開示された方法に従って外部及び内部の両方のプライマー・セットのアニーリング時間及び濃度を制御することにより、反応混合物容器から外部プライマーを減少させることなく又は除去することなく1つの反応混合物容器中でDNAの標的部分の高度に特異的でかつ効率的な増幅が達成できる、DNAの標的部分の組重ね式複製連鎖反応(PCR)増幅を行う改良方法。

Claim (excerpt)：

第1段階で外部プライマー対に隣接した核酸セグメントを増幅しそして第2段階で内部組重ね式プライマー対に隣接した核酸標的セグメントを増幅して、サンプル核酸反応混合物からの核酸の標的セグメントを選択的に増幅する組重ね式複製連鎖反応を行う改良方法において、 第1及び第2段階で外部及び内部プライマー対の濃度及びアニーリング時間を制御することにより、第2段階中に内部プライマー対で標的セグメントの選択的増幅が達成され、反応混合物からの外部プライマーを減少させることなく又は除去することなく第1段階反応混合物の全容量が第2段階に用いられるものであって、 外部プライマー対をサンプル核酸反応混合物に添加してP<SB>011</SB>で表される該外部プライマーの濃度を達成し; 各サイクルにおいてt<SB>1</SB>で表されるアニーリング時間で複製連鎖反応を繰り返し行い; 内部プライマー対をサンプル核酸反応混合物に添加してP<SB>022</SB>で表される該内部プライマーの濃度を達成し;そして 各サイクルにおいてt<SB>2</SB>で表されるアニーリング時間で複製連鎖反応を繰り返し行う; ここでP<SB>011</SB>、t<SB>1</SB>、P<SB>022</SB>及びt<SB>2</SB>は以下の式に従って選択される、 ε<SB>max</SB> <SB>1</SB>(1-exp-(k<SB>1</SB>P<SB>011</SB>t<SB>1</SB>))>0.4 ε<SB>max 2</SB>(1-exp-(k<SB>2</SB>P<SB>022</SB>t<SB>2</SB>))>0.4 ε<SB>max 1</SB>(1-exp(-k<SB>1</SB>P<SB>012</SB>t<SB>2</SB>))<1/5ε<SB>max 2</SB>(1-exp(-k<SB>2</SB>P<SB>022</SB>t<SB>2</SB>)) 式中、 P<SB>011</SB>は第1段階における各外部プライマーの濃度であり; P<SB>022</SB>は第2段階における各内部プライマーの濃度であり; P<SB>012</SB>は第2段階における各外部プライマーの濃度であり; t<SB>1</SB>は第1段階におけるアニーリング時間であり; t<SB>2</SB>は第2段階におけるアニーリング時間であり; k<SB>1</SB>は外部プライマーから伸長産物を形成する二次速度定数であり; k<SB>2</SB>は内部プライマーから伸長産物を形成する二次速度定数であり; ε<SB>max 1</SB>は1サイクル当たりの外部プライマーの最大伸長であり;そして ε<SB>max 2</SB>は1サイクル当たりの内部プライマーの最大伸長である、工程を含んでなる該改良方法。

IPC (3)：

C12Q 1/68 ,  C07H 21/04 ,  C12N 15/09 ZNA