カビ類ポリケチド合成遺伝子の酵母での異種発現

発明者： ,
出願人/特許権者： ,
代理人 (5件)：大野聖二 , 田中玲子 , 松任谷優子 , 北野健 , 伊藤奈月
公報種別：再公表公報
出願番号（国際出願番号）：JP2011004566
公開番号（公開出願番号）：WO2012-020574
出願日： 2011年08月11日
公開日（公表日）： 2012年02月16日
要約：

本発明は、真核生物が有するイントロンを含む遺伝子から、該遺伝子に含まれるイントロンを除去してエクソン配列のみを連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法に関する。詳しくは、イントロンを含むカビの巨大遺伝子から、エクソン配列を一または複数のフラグメントとしてPCRにより増幅し、ギャップリペアークローニング法を利用して該フラグメントおよび制限酵素処理したベクターを連結し、連結されたエクソン配列を含む発現ベクターを作製する方法、巨大遺伝子のcDNAフラグメントを合成して連結し、全長cDNA配列を含む発現ベクターを作製する方法、該方法により作製された発現ベクターが導入された形質転換体、該形質転換体により産生されるタンパク質、ならびに該発現ベクターを用いて該タンパク質により産生される化合物を得る方法に関する。

請求項（抜粋）：

真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、エクソン配列を連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、 (a)真核生物から抽出したゲノムから、PCRにより、エクソン配列を複数のフラグメントとして増幅する工程、ここで、PCRに用いるフォワードプライマーは、5’末端から3’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の5’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、5’末端から3’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の5’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および (b)工程(a)により得られたフラグメントと、制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程を含む該方法。

IPC (5件)：

C12N 15/09 , C12N 1/15 , C12N 1/19 , C12N 1/21 , C12N 5/10

FI (5件)：

C12N15/00 A , C12N1/15 , C12N1/19 , C12N1/21 , C12N5/00 101

Fターム (20件)：

4B024AA01 , 4B024AA20 , 4B024BA07 , 4B024CA04 , 4B024DA12 , 4B024EA04 , 4B024FA02 , 4B024GA11 , 4B024HA03 , 4B065AA01X , 4B065AA57X , 4B065AA57Y , 4B065AA60Y , 4B065AA67Y , 4B065AA72Y , 4B065AA90X , 4B065AB01 , 4B065BA02 , 4B065CA27 , 4B065CA44

前のページに戻る