二重鎖切断部位に対向するプライマーの対は1bp分解能でのNHEJ仲介インデル変異の検出を可能にする【JST・京大機械翻訳】

Ijaz, F.; Nakazato, R.; Setou, M.; Ikegami, K.

プレプリント

J-GLOBAL ID：202202213310852404 整理番号：22P0314591

二重鎖切断部位に対向するプライマーの対は1bp分解能でのNHEJ仲介インデル変異の検出を可能にする【JST・京大機械翻訳】

A pair of primers facing at the double-strand break site enables to detect NHEJ-mediated indel mutations at a 1-bp resolution

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発行年： 2022年02月07日プレプリントサーバーでの情報更新日： 2022年02月07日
JST資料番号： O7001B 資料種別：プレプリント
記事区分：プレプリント発行国：アメリカ合衆国 (USA) 言語：英語 (EN)

Cas9のような部位特異的ヌクレアーゼによる遺伝子のコード領域における小さな挿入/欠失(インデル)変異の導入は,研究者がフレームシフトヌル変異体を得ることを可能にする。技術的に単純かつ高価な合理的な遺伝子型決定法は,フレームシフトヌル変異体候補を効率的にスクリーニングするために待たれる。ここでは,前方および逆プライマーの3末端がPAM配列の3bpと4bp上流の位置で互いに向かい,一般的にCas9仲介二本鎖切断部位である,”面対面”プライマーを用いたDST-PCR(Double-ストランド切断部位-Targeted PCR)と呼ばれる簡単な遺伝子型決定法を開発した。遺伝子化されたアンプリコンは,1bpの分解能で突然変異体クローン検出のために,高濃度のビスアクリルアミドを含むTBE-High-Resolution PAGEに直接曝されている。CRISPR/Cas9工学ノックアウト細胞の6つの例を示し,著者らのアプローチを利用した潜在的KO細胞クローンを得るためにインデルをスクリーニングした。この方法は,変異体細胞クローンの1つまたは2つの対立遺伝子における1-bpから2-bp挿入および1-bpの4-bp欠失への検出を可能にした。さらに,この技術はヘテロ接合性及びホモ接合性二対立遺伝子機能KO候補の同定を可能にした。このように,TBE-High-Resolution PAGEと組み合わせたDST-PCRは,CRISPR/Cas9工学細胞株の遺伝子型決定のための簡単な方法であり,特別な装置や技術なしで行うことができる。【JST・京大機械翻訳】

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遺伝子操作

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