予測祖先Sykファミリーキナーゼの飽和変異誘発【JST・京大機械翻訳】

Hobbs, H. T.; Shah, N. H.; Shoemaker, S. R.; Amacher, J. F.; Marqusee, S.; Kuriyan, J.

プレプリント

J-GLOBAL ID：202202213674738364 整理番号：22P0339081

予測祖先Sykファミリーキナーゼの飽和変異誘発【JST・京大機械翻訳】

Saturation mutagenesis of a predicted ancestral Syk-family kinase

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発行年： 2022年04月24日プレプリントサーバーでの情報更新日： 2022年04月24日
JST資料番号： O7001B 資料種別：プレプリント
記事区分：プレプリント発行国：アメリカ合衆国 (USA) 言語：英語 (EN)

多くのチロシンキナーゼは大腸菌で容易に発現できず,生化学実験のためのこれらの蛋白質の容易な生産を制限する。祖先配列再構成を用いて,細菌で発現し,可溶性型で精製した脾臓チロシンキナーゼ(Syk)変異体を作成し,このファミリーのヒトメンバー(SykとZAP-70)とは違った。このSyk変異体のリン酸化による触媒活性,基質特異性および調節は,ヒトSykおよびZAP-70の対応する性質と類似している。この新規Sykファミリーキナーゼを細菌に発現させる能力を利用して,抗生物質の存在下で大腸菌の増殖を結合させ,キナーゼによるベイトペプチドのリン酸化を成功させる2ハイブリッドアッセイを開発した。このアッセイを用いて,この再構成Sykファミリーキナーゼのキナーゼドメインの部位特異的変異誘発ライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングで同定された機能喪失突然変異の部位は,蛋白質キナーゼにおける機能および/または構造に重要なものとして確立された残基と良く相関した。また,キナーゼ調節に関与する重要なモチーフである調節疎水性脊椎および活性化ループにおける活性化変異を同定した。驚くべきことに,祖先Sykファミリー変異体における1つの変異は,蛋白質の可溶性発現を75倍増加させた。このように,先祖配列再構成とそれに続く深い変異走査により,非常に高い収率で細菌で発現するSykファミリーキナーゼ変異体を作成した。【JST・京大機械翻訳】

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細胞生理一般

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