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J-GLOBAL ID：201303071801667980

カビ類ポリケチド合成遺伝子の酵母での異種発現

Inventor： 渡辺 賢二 ,  守屋 央朗
Applicant, Patent owner： 静岡県公立大学法人 ,  国立大学法人 岡山大学
Agent (5)： 大野 聖二 ,  田中 玲子 ,  松任谷 優子 ,  北野 健 ,  伊藤 奈月
Gazette classification：再公表公報
Application number (International application number)：JP2011004566
Publication number (International publication number)：WO2012020574
Application date： Aug. 11, 2011
Publication date： Feb. 16, 2012
Summary：

本発明は、真核生物が有するイントロンを含む遺伝子から、該遺伝子に含まれるイントロンを除去してエクソン配列のみを連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法に関する。詳しくは、イントロンを含むカビの巨大遺伝子から、エクソン配列を一または複数のフラグメントとしてPCRにより増幅し、ギャップリペアークローニング法を利用して該フラグメントおよび制限酵素処理したベクターを連結し、連結されたエクソン配列を含む発現ベクターを作製する方法、巨大遺伝子のcDNAフラグメントを合成して連結し、全長cDNA配列を含む発現ベクターを作製する方法、該方法により作製された発現ベクターが導入された形質転換体、該形質転換体により産生されるタンパク質、ならびに該発現ベクターを用いて該タンパク質により産生される化合物を得る方法に関する。

Claim (excerpt)：

真核生物が有する、イントロンを含む遺伝子または遺伝子と推定されているゲノム配列の、エクソン配列を連結し、該連結された配列を含む発現ベクターを作製する方法であって、 (a)真核生物から抽出したゲノムから、PCRにより、エクソン配列を複数のフラグメントとして増幅する工程、 ここで、PCRに用いるフォワードプライマーは、5’末端から3’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのセンス鎖の5’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、リバースプライマーは、5’末端から3’末端の方向に順番に、増幅するフラグメントを連結させるフラグメントのアンチセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、またはベクターの制限酵素処理末端部分のアンチセンス鎖の3’末端部分の配列に相補的な配列、および増幅するフラグメントのアンチセンス鎖の5’末端部分の配列に相補的な配列を持ち、これらのプライマーを用いることにより、増幅するフラグメントの末端に、該フラグメントに連結させるフラグメントの末端部分と相同な配列またはベクターの制限酵素処理末端部分と相同な配列を付加する、および (b)工程(a)により得られたフラグメントと、制限酵素処理したベクターとを出芽酵母または分裂酵母に同時に形質転換することにより、相同組換えによってフラグメントとフラグメント、およびフラグメントとベクターとが連結された発現ベクターを得る工程 を含む該方法。

IPC (5)：

C12N 15/09 ,  C12N 1/15 ,  C12N 1/19 ,  C12N 1/21 ,  C12N 5/10

FI (5)：

C12N15/00 A ,  C12N1/15 ,  C12N1/19 ,  C12N1/21 ,  C12N5/00 101

F-Term (20)：

4B024AA01 ,  4B024AA20 ,  4B024BA07 ,  4B024CA04 ,  4B024DA12 ,  4B024EA04 ,  4B024FA02 ,  4B024GA11 ,  4B024HA03 ,  4B065AA01X ,  4B065AA57X ,  4B065AA57Y ,  4B065AA60Y ,  4B065AA67Y ,  4B065AA72Y ,  4B065AA90X ,  4B065AB01 ,  4B065BA02 ,  4B065CA27 ,  4B065CA44