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J-GLOBAL ID：201803017605488469

核酸の定量方法、それに使用されるプライマーセット、DNAチップおよびアッセイキット、並びにそれを利用する常在菌の判定方法

Inventor： 林 智人 ,  勝田 賢 ,  秦 英司 ,  田川 裕一 ,  河合 一洋 ,  橋本 みちえ ,  海野 洋敬 ,  橋本 幸二
Applicant, Patent owner： 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構 ,  学校法人麻布獣医学園 ,  東芝メディカルシステムズ株式会社
Agent (1)： 特許業務法人スズエ国際特許事務所
Gazette classification：特許公報
Application number (International application number)：2013192051
Publication number (International publication number)：2015057958
Patent number：6226460
Application date： Sep. 17, 2013
Publication date： Mar. 30, 2015
Claim (excerpt)：

【請求項1】 検体中に含まれる特定の核酸を定量する方法であって、 (a)核酸を含む検体を準備することと、 (b)その5’末端側からF3領域、F2領域、第1のプローブ結合領域およびF1領域をこの順番で含み、且つ3’末端側からB3c領域、B2c領域、LBc領域およびB1c領域をこの順番で含む、第1の標的鋳型配列を増幅するための第1のプライマーと第2のプライマーとを含むプライマーセットであり、前記第1のプライマーが、5’末端側にF1に相補的なF1c配列を有し、且つ3’末端側にF2に同じF2配列を有するFIPプライマーであり、前記第2のプライマーが5’末端側にB1cに同じB1c配列を有し、且つ3’末端側にB2cに相補的なB2配列を有するBIPプライマーであるプライマーセットを準備することと、 (c)第1の濃度標準核酸〜第nの濃度標準核酸を準備することと;ここで、nは、2以上の整数であり、前記第1の濃度標準核酸は、その5’末端側からF3領域と、F2領域と、前記第1のプローブ結合領域とは配列が異なる第21のプローブ結合領域と、F1領域とをこの順番で含み、且つ3’末端側からB3c領域と、B2c領域と、LBc領域と、B1c領域とをこの順番で含み、第nの濃度標準核酸は、その5’末端側からF3領域と、F2領域と、他のプローブ結合領域とは配列の異なる第2nのプローブ結合領域と、F1領域とをこの順番でそれぞれ含み、且つ3’末端側からB3c領域と、B2c領域と、LBc領域と、B1c領域とをこの順番でそれぞれ含み、 (d)互いに異なる濃度である第1〜第nの濃度をそれぞれ有する前記第1〜第nの濃度標準核酸を1種類ずつを、前記検体と、前記プライマーセットとともに第1〜第nの反応環境内に持ち込み、前記第1〜第nの反応環境のそれぞれにおいてLAMP法により増幅反応を行って第1〜第nの増幅産物を得ることと;ここで、前記各第1〜第nの反応環境において前記第1の標的鋳型配列の増幅と前記濃度標準核酸の増幅とは競合的に行われ、前記第1の標的鋳型配列及び前記濃度標準核酸のうち、より多く存在する方が優先的に増幅される、 (e)前記第1〜第nの増幅産物を一つに併せることと、 (f)基体の第1の固定化領域に固定化され、前記F2領域および第1のプローブ結合領域を含む第1の標的配列またはその相補配列に相補的な第1の核酸プローブと、前記基体の第21〜第2nの固定化領域にそれぞれ固定化され、前記F2領域および第21〜第2nのプローブ結合領域をそれぞれ含む第21〜第2nの標的配列またはその相補配列に相補的な第21〜第2nの核酸プローブと、前記(e)で得られた前記併せた増幅産物とを反応させることと、 (g)前記(f)において生じた第1および第21〜第2nの核酸プローブのそれぞれについてのハイブリダイズ信号をそれぞれ検出し、 (1)前記第21〜第2nの核酸プローブの全ての前記ハイブリダイズ信号が、前記第1の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の2倍以上である場合、前記第1の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記第1〜第nの濃度のうち最も低い濃度以下であると判定し、 (2)前記第21〜第2nの核酸プローブの中で、前記ハイブリダイズ信号が、前記全ての核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号のうち最も小さいものの2倍以上である(以下、「ハイブリダイズ信号が多い」と記す)ものと、前記第1の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満であるものとが両方存在する場合、前記第1の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記ハイブリダイズ信号が多い前記第21〜第2nの核酸プローブの前記第1〜第nの濃度のうち最も低い濃度と同じ濃度であると判定し、 (3)前記第21〜第2nの核酸プローブの全ての前記ハイブリダイズ信号が、前記第1の核酸プローブの前記ハイブリダイズ信号の半分未満である場合、前記第1の標的鋳型配列の前記検体中の存在量は、前記第1〜第nの濃度のうち最も高い濃度以上であると判定する ことにより前記検体に含まれる特定の核酸を半定量することと、 を含む方法。

IPC (4)：

C12N 15/09 ( 200 6.01) ,  C12Q 1/68 ( 200 6.01) ,  C12M 1/00 ( 200 6.01) ,  C12M 1/34 ( 200 6.01)

FI (4)：

C12N 15/00 ZNA A ,  C12Q 1/68 A ,  C12M 1/00 A ,  C12M 1/34 B

Patent cited by the Patent：

Cited by examiner (3)

• 核酸の新規測定方法
  Gazette classification：公開公報   Application number：特願2003-117140   Applicant：環境エンジニアリング株式会社, 独立行政法人産業技術総合研究所
• 遺伝子組換え体の定量的検知方法
  Gazette classification：公開公報   Application number：特願2007-231278   Applicant：独立行政法人産業技術総合研究所
• 内部標準DNAの製造方法
  Gazette classification：公開公報   Application number：特願2008-191975   Applicant：キヤノン株式会社

Article cited by the Patent：

Cited by examiner (1)

• Anal. Chem., 2007, Vol.79, pp.5608-5613