特許
J-GLOBAL ID：201103078412521440
DNA増幅法および配列決定方法
発明者：
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出願人/特許権者：
代理人 (4件)：
浅村 皓
, 浅村 肇
, 長沼 暉夫
, 池田 幸弘
公報種別：特許公報
出願番号（国際出願番号）：特願2000-531590
特許番号：特許第4393700号
出願日： 1999年02月08日
請求項（抜粋）：
【請求項1】 循環プライマー伸長反応を実施するための方法であって、
(i)ヌクレオチドの標的配列を含む鋳型DNAを、該標的配列の3’末端のヌクレオチド配列に相補的な少なくとも1つのプライマーオリゴヌクレオチドと、該プライマーを該標的配列上のその相補的ヌクレオチド配列にアニーリングさせる条件下で、該鋳型DNAおよび/または該プライマーの融点を低下させるためにプロリン単独およびプロリンと2-メチル-4-カルボキシ-3,4,5,6-テトラヒドロピリミジン[THP(B)]との組み合わせから選択される浸透圧保護剤(osmoprotectant)の存在下で、接触させる工程;
(ii)ヌクレオチドの該標的配列への該プライマーのポリメラーゼ介在性伸長を、該ポリメラーゼを安定化するためにプロリン単独、プロリンとTHP(B)との組み合わせ、プロリンと2-メチル-4-カルボキシ-5-ヒドロキシ-3,4,5,6-テトラヒドロピリミジン[THP(A)]との組み合わせ、およびプロリンとTHP(B)とTHP(A)との組み合わせから選択される浸透圧保護剤の存在下で行う工程;および
(iii)工程(i)および(ii)を、複数回繰り返す工程であって、各工程(i)の前に、該鋳型DNAをその鎖に分離し、かつ工程(ii)のポリメラーゼ伸長プライマーをそのヌクレオチドの相補的標的配列から分離するのに適切な温度で、DNA熱変性が行われ、該温度は、工程(ii)において使用されるポリメラーゼが安定な温度である、上記工程;
を含む、循環プライマー伸長反応を実施するための方法であり、
プロリン単独で使用するときには、プロリンは3.0-5.5Mの量で存在し、そして、プロリンとTHP(B)との組み合わせ、プロリンとTHP(A)との組み合わせ、またはプロリンとTHP(B)とTHP(A)との組み合わせで使用するときは、プロリンは1-5Mの量で存在し、THP(A)は0.5-3Mの量で存在し、THP(B)は0.5-3.5Mの量で存在し、プロリン単独での存在下では、循環プライマー伸長反応を実施するための非熱安定性ポリメラーゼを用い、プロリンにより、非熱安定性ポリメラーゼはそうでなければ熱不活性化に感受性となる高温での実施が可能となり、
こうして鋳型DNAのヌクレオチドの該標的配列へのプライマーの高収率で特異的な伸長を得る、上記方法。
IPC (2件)：
C12Q 1/68 ( 200 6.01)
, C12N 15/09 ( 200 6.01)
C12Q 1/68 A
, C12N 15/00 ZNA A
